化斑解毒方对咪喹莫特诱导银屑病样皮炎小鼠模型抗炎机制探究

于心荟 李元文 任雪雯 邓宇童 王莹 王化龙 刘晓东 冯蕙裳

银屑病是一种常见的慢性炎症性复发性皮肤疾病,临床表现主要是鳞屑性红斑或斑块,世界范围内发病率约1%～3%[1]。免疫异常被视为银屑病发病的重要环节,免疫细胞激活后产生多种炎症细胞因子,促进细胞增殖角化及炎症细胞浸润,导致银屑病的发生发展。化斑解毒方是李元文教授通过前期数据挖掘结合多年的临床经验与理论探索总结出的中药方剂[2],临床应用于寻常型银屑病血热证患者具有确切疗效,能够有效减轻患者皮肤炎症反应,但其治疗银屑病的作用机制尚不明确。本研究拟通过测定不同浓度的化斑解毒方对咪喹莫特诱导银屑病样皮炎小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表达水平的影响,探究其治疗银屑病的抗炎作用,并为化斑解毒方的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性BALB/c小鼠60只,8周龄,体质量约20 g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物质量合格证号:110324221101061643;实验动物生产许可证号:SCKX(京)2019-0010。小鼠于北京中医药大学动物房适应性喂养1周后开始实验。

1.2 实验药物

化斑解毒方组成:白花蛇舌草30 g、半枝莲15 g、威灵仙10 g、苍术10 g、土茯苓15 g、生槐花10 g、玄参20 g、生地10 g、香附10 g、牛蒡子10 g、知母10 g、金银花15 g、猪苓10 g、白术10 g、炙甘草6 g。所用药物为颗粒剂,由江阴天江药业有限公司配制,产品批号2202306。

甲氨蝶呤片(通化茂祥制药有限公司,产品批号:197220504,规格:2.5 mg);咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司,产品批号40220501,规格:250 mg∶12.5 mg)。

1.3 主要实验试剂与仪器

凡士林(德新康,批号:Q/371426DXK027);4%多聚甲醛(Solarbio,批号:P1110);苏木素—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(北京中科万邦生物科技有限公司,批号:RY-0002);中性树胶封片剂(北京中科万邦生物科技有限公司,批号:FP-0001);TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23酶联免疫吸附试验试剂盒(北京百奥思科生物医学技术有限公司,批号分别为:MD7125、MD16214、MD124889、MD53662);NF-κBp65抗体(Abcam,批号:AB32536);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(Affinity,批号:T0021)。

数码相机(Leica);JT-12S脱水机、JB-P7包埋机(武汉俊杰电子有限公司);电泳仪(美国Bio-Rad);Spectramac M3多功能酶标仪(美国MD);紫外分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司);ST16R高速冷冻离心机(美国Thermo Sorvall);THZ-312 台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司);化学发光成像系统(美国ChemiDoc MP)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组与造模 将60只小鼠适应性喂养1周后,全部予背部去毛,面积约2 cm×3 cm。以随机数字表法将60只小鼠随机分为空白组、模型组、化斑解毒方低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组,每组10只。脱毛后24小时确认小鼠脱毛处无损伤后开始造模,空白组小鼠于备皮区每日涂抹凡士林62.5 mg,其余各组涂抹等质量5%咪喹莫特乳膏,连续7天。

1.4.2 给药方法 造模后,各组均以标准饲料喂养并自由饮水,每3天更换垫料。造模开始第二日予以干预,每组小鼠以0.1 mL/(10 g·d)灌胃1次,空白组与模型组小鼠予以蒸馏水,化斑解毒方低、中、高剂量组分别予中药1/2倍、1倍及2倍量,甲氨蝶呤组予甲氨蝶呤片混悬液。小鼠灌胃药物剂量根据体表法进行计算,根据标准成年人体质量70 kg,则对应小鼠药物剂量约为成人的9.1倍,折算出化斑解毒方中剂量组小鼠每日给药剂量为24.83 g/kg,甲氨蝶呤组每日给药剂量为1 mg/kg。

1.4.3 取材方法 在实验第7天进行标本制备,对小鼠予4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射进行麻醉。取小鼠背部银屑病皮损集中皮肤(全层创面),面积为2 cm×2 cm的正方形,空白组取相同部位,所得皮肤组织以90°为范围平均分为4份,3份置于无菌无酶冻存管,置于液氮冷冻后,放于-80℃超低温冰箱保存用于做蛋白检测;1份放于4%多聚甲醛中固定,用于切片染色。

1.5 观察指标

1.5.1 各组小鼠皮损变化情况评价 于模型建立及治疗期间,每日观察各组小鼠皮损变化,并采用数码相机对同一部位拍照记录。观察期间无小鼠死亡情况,重复数量为1。根据校正后的银屑病样皮损面积和疾病严重程度(psoriasis area and severity index,PASI)评分作为标准,对鳞屑、浸润、红斑的严重程度进行评分,由轻到重分为5个等级,从0到4进行赋分。计算三项评分之和表示皮损严重程度;取每日各组总分平均值绘制趋势线,从而反映小鼠皮损的变化情况。

1.5.2 皮肤组织HE染色及观察 取固定于4%多聚甲醛中的皮肤组织,修剪至合适大小,二甲苯脱蜡后,用从高到低浓度酒精及蒸馏水洗脱,苏木素水溶液染色10分钟,0.7%盐酸乙醇分化30秒,置于酒精中脱水,酒精伊红染色2分钟,冲洗后先后酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,放置于显微镜下观察并摄片。

1.5.3 皮肤组织炎症因子水平检测 采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组小鼠皮肤组织匀浆中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23水平。将试剂盒取出平衡至室温,取出冰箱中冻存的皮肤样本研碎。实验操作步骤以ELISA检测试剂盒为准。显色后立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度值(OD值),绘制浓度标准曲线计算样品中相应检测目标的浓度。

以蛋白免疫印迹法检测皮肤标本中NF-κB水平。取出冻存标本加入裂解液,超声破碎细胞取上清,按照BCA试剂盒说明书对蛋白定量,对蛋白样品进行电泳及转膜。将转移膜置于封闭液中封闭1小时,加入用封闭液稀释的一抗工作液4℃孵育过夜,洗净后加入二抗工作液室温孵育60分钟,洗膜后使用显色剂显影,利用化学发光成像系统成像并通过测定主带的光密度值计算上述蛋白在皮肤组织中的表达水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 皮损变化及评分比较

空白组小鼠未见皮损,模型组小鼠皮肤存在不同程度红斑、浸润、鳞屑等皮肤损害。与模型组相比,化斑解毒方各剂量组及甲氨蝶呤组小鼠皮肤红斑色泽、浸润程度、出现鳞屑皮肤面积大小、鳞屑厚度均较轻。第7天时,化斑解毒方低、中、高剂量组、甲氨蝶呤组小鼠皮损相比于模型组,红斑面积较小、颜色浅,皮肤浸润程度较轻,鳞屑较少。见图1。

注A 空白组;B 模型组;C 化斑解毒方低剂量组;D 化斑解毒方中剂量组;E 化斑解毒方高剂量组;F 甲氨蝶呤组。图1 各组银屑病样皮炎小鼠皮肤表现

皮损评分结果显示,空白组与模型组之间PASI评分存在统计学差异(P<0.05);与模型组相比,化斑解毒方各剂量组及甲氨蝶呤组PASI评分降低,皮损症状改善(P<0.05)。依据PASI评分绘制化斑解毒方各剂量组与模型组、甲氨蝶呤组的7日曲线可观察评分变化。见图2,表1。

表1 各组银屑病样皮炎小鼠PASI评分比较

图2 各组银屑病样皮炎小鼠PASI评分变化曲线

2.2 皮肤组织学变化

HE染色显示:空白组角质层细胞未见明显异常,基底层细胞连续,血管周围及真皮浅层未见炎症细胞浸润;模型组表现为表皮角化过度伴角化不全,棘细胞数量增加,棘层肥厚,表皮突向下延伸呈棒槌状,真皮内可见毛细血管扩张,血管周围淋巴细胞浸润,类似银屑病的皮损病理表现;与模型组相比,化斑解毒方各剂量组和甲氨蝶呤组小鼠病理损害程度较低,表皮角化不全减轻,棘层厚度变薄,淋巴细胞浸润减少。见图3。

注A 空白组;B 模型组;C 化斑解毒方低剂量组;D 化斑解毒方中剂量组;E 化斑解毒方高剂量组;F 甲氨蝶呤组。图3 各组银屑病样皮炎小鼠皮肤病理变化比较(HE染色,×400)

2.3 皮肤组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23表达情况

与空白组相比,模型组小鼠皮肤组织中TNF-α、IFN-γ、IL-23、IL-1β表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,各用药组炎症因子水平均有不同程度降低,其中以甲氨蝶呤组及化斑解毒方高剂量组最为显著;另外,化斑解毒方低剂量组与模型组IL-23表达水平无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组银屑病样皮炎小鼠皮肤组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23表达水比较

2.4 皮肤组织中NF-кB表达水平

与空白组相比,模型组NF-кB表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,各用药组NF-кB表达水平显著降低(P<0.05);化斑解毒方各剂量组NF-кB表达水平较甲氨蝶呤组无显著差异(P>0.05)。因空白组中两个数据离散度过大,考虑误差,在统计过程中主动剔除。结果见表3及图4。

表3 各组银屑病样皮炎小鼠皮肤组织中NF-кB表达水平比较

注A 空白组;B 模型组;C 化斑解毒方低剂量组D 化斑解毒方中剂量组;E 化斑解毒方高剂量组;F 甲氨蝶呤组。图4 各组银屑病样皮炎小鼠皮肤组织中NF-кB蛋白表达情况

3 讨论

银屑病是皮肤科常见且重大的疾病,其发病机制复杂且尚不明确[3]。目前普遍认为银屑病的发病主要由免疫细胞介导的炎症反应、多种细胞因子失衡及细胞间信号转导通路异常等导致[4]。现代医学对轻度银屑病治疗以外用药为主,中、重度常联合甲氨蝶呤、阿维A酸、环孢素等系统治疗,近年来生物制剂也日益广泛应用于银屑病的治疗[5]。中药治疗相对安全且价格适中,探索更为稳定有效的中药方剂有助于解除银屑病患者的困扰,并为银屑病的临床治疗提供更多选择。

中医学普遍认为,银屑病发生与“血”与“风”两个因素密切相关,病机多为营血亏虚或外邪入里以致血热内蕴,生风化燥,肌肤失养,发为白疕[6]。李元文教授认为寻常型银屑病的病因病机在血热瘀阻、化燥生风的基础之上,兼有湿邪为患,且多与毒邪相关[7]。化斑解毒方在目前常用清热凉血解毒药如生地、玄参、知母、金银花、生槐花、白花蛇舌草、半枝莲、土茯苓之外[8],加用健脾化湿之苍术、白术、猪苓,佐以威灵仙通络,香附理气,旨在宣通中焦之气,气行则血行,气机通畅则瘀血得通、风邪自灭,故红斑鳞屑得以消减。化斑解毒方临床治疗寻常型银屑病疗效确切,但其治疗的分子层面的机制仍不明确,故本实验通过对不同浓度化斑解毒方的抗炎方面机制进行探究。

作为由免疫介导的炎症性皮肤病,银屑病的发生发展过程由多种免疫细胞和炎症因子共同作用。TNF-α是重要的促炎因子,可影响角质细胞的再生、诱导表皮中性粒细胞浸润,并可诱导免疫细胞增殖产生不同的趋化因子的细胞因子,加重炎症反应。IFN-γ能够增强抗原加工和呈递、诱导免疫反应,在银屑病患者血清中显著升高,并且可能与银屑病的活动有关[9]。IL-1β是在早起皮肤损伤中占主导地位的细胞因子,其增多导致早期银屑病炎症加重[10]。IL-23是银屑病免疫反应机制的上游炎症因子之一,可诱导Thl7细胞分化产生细胞因子,进一步促进角质形成细胞增殖及炎症级联反应[11]。本研究中,甲氨蝶呤组、化斑解毒方各剂量组TNF-α、IFN-γ、IL-1β表达水平较模型组显著降低,提示经治疗后细胞炎症因子水平下降,组织炎症缓解,同理甲氨蝶呤组与化斑解毒方中、高剂量组的IL-23表达水平降低亦提示炎症减轻。化斑解毒方高剂量组与甲氨蝶呤组TNF-α、IL-23表达水平无显著差异,提示二者在影响TNF-α、IL-23的作用上效果趋于相同。化斑解毒方低剂量组IL-23表达水平与模型组无显著差异,提示对此炎症因子作用效果不明显,考虑血药浓度可能未达到起效水平,或与造模用药时间较短等因素有关,具体原因需进一步探究。

NF-кB被认为是免疫及炎症反应的中心枢纽,激活后可诱导下游炎症因子和趋化因子表达,促进组织炎症发生[12]。NF-кB在银屑病过程中表达水平升高[13],并可调控细胞凋亡,影响银屑病炎症进展[14]。本研究结果显示,与空白组相比,模型组NF-кB表达水平显著升高,提示在咪喹莫特诱导银屑病样皮炎小鼠中NF-кB过度激活;与模型组相比,各用药组NF-кB显著下调,提示化斑解毒方的抗炎作用可能与抑制NF-кB表达有关,且下调情况在化斑解毒方各组间呈现一定的量效差异。化斑解毒方各剂量组NF-кB表达水平与甲氨蝶呤组无统计学差异,提示化斑解毒方可有效抑制银屑病皮损中的NF-кB表达,从而改善炎症反应。

综上所述,化斑解毒方在改善银屑病皮损症状及组织病理学表现上有确切治疗作用;同时在分子层面上,化斑解毒方能够通过降低TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23的表达水平、抑制NF-кB在组织细胞中的表达减轻炎症反应,起到抗炎作用,且化斑解毒方的抑制炎症作用与使用剂量呈正相关。但是,本研究所检测的只是银屑病炎症反应相关的部分细胞因子,没有涉及细胞通路及其他治疗机制方面的研究;且咪喹莫特诱导的小鼠模型不能完全代表人类银屑病的发展及转归过程。因此,探究化斑解毒方的作用机制仍需经过其他分子水平研究及临床实验进一步验证。