一种经济的乳兔骨髓来源的肥大细胞诱导培养及鉴定

王禹雪，张华莉，陈理军，陆永萍

（云南大学附属医院超声科，云南 昆明 650021）

九十年代初期的研究表明，在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成过程中，动脉内膜和外膜层聚集着肥大细胞（mast cells，MCs），首次提出MCs 参与AS 进程[1]。

血管的微环境一旦发生变化，炎性细胞便会从血管外膜的滋养血管中渗出，参与疾病的变化[2-3]。MCs 激活时释放出来的趋化因子、细胞因子、组胺、白三烯等炎症因子[4]使血管的通透性增加，导致单核巨噬细胞和淋巴细胞聚集到斑块处[5]，释放出大量的中性蛋白酶，可以加速低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）进入到血管内膜局部并聚集[6]，促进AS 斑块形成。

在骨髓细胞向MCs 分化及活化过程中白细胞介素3（interleukin-3，IL-3）和干细胞因子（stem cell factor，SCF）起到重要作用[7-8]。本研究旨在通过提取乳兔骨髓细胞，利用IL-3、SCF、β-巯基乙醇联合作用诱导培养骨髓来源肥大细胞并鉴定其纯度与活性，为进一步研究肥大细胞与AS 的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

IL-3、SCF（美 国Peprotech 公 司）；FBS、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640（美 国Gibco 公司）；实验动物：2 周龄乳兔，昆明医科大学实验动物学部，环境条件符合国家实验动物环境及设施标准要求，室内保持安静、清洁、干燥和通风。自由饮水。实验动物使用许可证号：SCXK（滇）2015-0002。

1.2 方法

1.2.1 兔骨髓细胞的获取麻醉：（经2 周龄乳兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，1 mL/kg）→浸泡（75%C2H5OH，10 min）→剥离（后肢皮肤切开，逐层分离，剥离肌肉）→暴露股骨→取出→浸泡（75% C2H5OH 的无菌培养皿中浸泡3～5 min）→股骨两端剪去→吹打骨髓（吸取DMEM 高糖培养基后吹打骨髓，股骨变白）→获取细胞（1 000 r/min，5 min。如果在获取的细胞中有较多红细胞，则应用红细胞裂解液进行处理）→培养体系（含84 mL DMEM 高糖培养基、15 mL FBS、1 mL 双抗）。

1.2.2 细胞的培养接种到T25 瓶中（含DMEM高糖培养基）→隔天换液→细胞铺满→消化细胞→新培养瓶→贴壁→改用F12 诱导培养基（含84 mL DMEM/F12、15 mL FBS、1 mL 双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3 及0、10×10-5mol/L 的β-巯基乙醇）→放置37 ℃、5% CO2饱和湿度环境→隔天换液→镜下观察细胞有变圆→更换为1640 促成熟培养基（含84 mL RPMI 1640、15 mFBS、1 mL双抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3 及0、10×10-5mol/L 的β-巯基乙醇）→7 d 换液→直至细胞诱导成熟。

1.2.3 肥大细胞功能学鉴定诱导成熟的重悬细胞液→载玻片→干燥→甲苯胺蓝染色→95%C2H5OH 脱色→清洗→镜下观察。

1.2.4 肥大细胞形态学鉴定通过光镜下观察不同培养时间的细胞形态，直至诱导成熟。

消化细胞→洗2 次（PBS）→细胞密度1×107个/mL→每管100 µL→单染管各加入5.0 µL 的 CD117-PE 抗体及FcεR1α-FITC 抗体→双染管加两种抗体→空白对照管（无抗体）→避光孵育30 min→每管加1 mL PBS→离心10 min（400 g）→去上清→上法洗涤1 次→去上清→每管加100 µL PBS→检测。

2 结果

2.1 光镜下观察肥大细胞生长形态

2 d 后开始出现以形态为长梭形的贴壁细胞；7 d 时：细胞基本将培养瓶铺满；2 周时：细胞逐渐变形；4 周时：细胞基本变为圆形，悬浮细胞变多；6 周时：细胞基本变为类圆形，且形态均匀具有折光性（图1）。

图1 肥大细胞变形过程（100×）Fig.1 Changes in mast cells（100×）

2.2 肥大细胞的甲苯胺蓝染色

培养6 周细胞成熟后利用甲苯胺蓝染色：可以观察到细胞质为紫红色，细胞核为蓝色。异染颗粒的细胞加入β-巯基乙醇比不加入β-巯基乙醇的能得到更多（图2）。

图2 甲苯胺蓝染色（100×）Fig.2 Toluene blue staining（100×）

2.3 流式细胞术检测肥大细胞

培养6 周收集细胞，利用流式细胞术检测细胞表面CD117 及FcεR1α 的表达情况，加入β-巯基乙醇双阳性细胞的比例达96.2%，大于不加入β-巯基乙醇的（图3），且与不加β-巯基乙醇相比有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 不同浓度β-巯基乙醇诱导后CD117+FcεRIα+肥大细胞的比例Tab.1 The proportion of CD117+FcεRIα+mast cells induced by different concentrations of βmercaptoethanol

图3 流式细胞仪检测细胞的双阳性率Fig.3 Double positive rate of cells detected by flow cytometry

3 讨论

在正常人的心脏、主动脉及脂肪组织中有少量的MCs 存在，当人类发生疾病时MCs 的数量就会增多，比如AS。近年来，研究表明MCs 在AS的发生、发展及斑块稳定性中有着重要作用[9]。

当下有研究认为MCs 是利用其表面的趋化因子受体-3 与AS 斑块中表达的嗜酸细胞活化CC趋化因子亚族中趋化因子配体-11 结合而向病变部位聚集[10]。MCs 起源于骨髓造血干细胞[11]，促进MCs 成熟的分子主要有SCF 和神经生长因子（nerve growthfactor，NGF）[17]，SCF 可能在MCs 向受累区域聚集发挥作用，而MCs 侵入受累区域可能会进一步导致更多的炎性细胞浸润，促进AS斑块形成。

IL-3 又被叫做肥大细胞生长因子，在MCs 的生长、分化、迁移和效应中具有重要作用。活化T 细胞、天然杀伤（NK）细胞和MCs 都可产生IL-3，且对于SCF 在MCs 前体的发生、发展、扩增具有促进意义[12-13]。SCF 的配体CD117（c-kit）除在其表面外，各种造血祖细胞中均可存在。MCs发挥重要表面标志的是FcεRIα，但FcεRIα还表达于嗜酸性粒细胞等细胞表面，只有MCs 同时表达CD117 和FcεRIα[14]。甲苯胺蓝染色是一种常用于识别及判断MCs 功能状态的方法，同时也是MCs 的特异性染色，可染细胞核为蓝色，胞质内为异染性紫红色颗粒，说明其具有吞噬功能[15]。通过甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测结果对诱导获得的MCs 的纯度进行鉴定，就目前来说，利用兔的骨髓间质干细胞来诱导培养MCs 的报道是极少的。

本研究选用2 周龄的乳兔来获取骨髓间质干细胞，因为当兔龄大于或者小于2 周龄时，笔者发现细胞生长速度变得缓慢，可能是2 周龄的骨髓间质干细胞的活性更好，更有利于细胞的培养。当IL-3 浓度10 ng/mL、SCF 浓度为10 ng/mL，加入β-巯基乙醇时：甲苯胺蓝染色及流式检测均较不加入β-巯基乙醇时可以获取更多、双阳性率更高的MSc，原因可能为β-巯基乙醇作为一种还原剂，在降低氧对细胞产生氧化损伤的同时促进干细胞生长。所以该培养体系是一种良好的体外诱导培养体系，其操作简单，且能获得更加成熟、更具有典型特征的MCs，为下一步对兔行进炎性损伤研究提供了优势。综上所述，本研究利用形态学、功能学2 个方面对诱导的兔骨髓来源MCs 进行鉴定，培养出的细胞不仅具有成熟MCs 的生物学特性，还具有其功能，这便为后续的基础研究及临床研究奠定基础。