UPLC-MS/MS法同时测定发酵面制品中7种甜味剂

蒋叶灵 侯绪和 吕保樱

摘 要：应用超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）实现发酵面制品的7种甜味剂（糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、三氯蔗糖）同时检测。样品经机械震荡、超声萃取，亚铁氰化钾溶液和乙酸锌沉淀蛋白，经0.22 μm滤膜过滤预处理，以Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）和乙腈-水为流动相梯度洗脱；电喷雾负离子模式（ESI-）下采用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式进行分段采集。实验结果：7种甜味剂在0.01～0.50 μg/mL浓度范围内线性关系较好，相关系数r2均大于0.999 1，检出限为3.0×10-6～3.0×10-4 g/kg，定量限为1.0×10-5～1.0×10-3 g/kg，样品平均加标回收率为84.5%～96.5%，相对标准偏差为1.3%～8.1%（n = 6）。实验结果表明：该方法快速、准确、重现性好，在各种发酵面制品检测中有广泛的应用前景。

关键词：甜味剂；发酵面制品；超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）

中图分类号：TS213.2 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2023.03.018

0 引言

发酵面制品是指以面粉为主要成分，经由和面-发酵-熟制而成的一类食品，包括馒头、包子、花卷、蒸糕等，是我国北方居民的主要粮食，占其主食的70%以上[1]，其中馒头是60%以上消费者的主食[2]。可见发酵面制品在人们的生活中占据着重要的地位。甜味剂能够增加食品的甜度，增强食品的口感[3]。目前，我国使用的甜味剂主要有安赛蜜、三氯蔗糖、甜蜜素、糖精钠、纽甜等化学合成甜味剂。化学合成甜味剂的长期大量摄入可能会引起肠道菌群结构和组成改变，使用量过大可导致血糖高、葡萄糖不耐受等代谢系统疾病，甚至会导致脾气暴躁、性格压抑、记忆力衰退、阿尔兹海默症等神经系统异常及致癌[4-7]。在《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[8]中规定发酵面制品中均不得使用上述化学合成甜味剂，然而部分商家为了追求经济效益，存在滥用、违规使用等不规范行为。

常用的化学合成甜味剂检测方法主要有气相色谱法[9-10]、离子色谱法[11]、高效液相色谱法[12-14]、高效液相色谱-串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[15-16]等。使用气相色谱法进行检测需要进行衍生化处理后方能使用，操作繁琐，在食品检验中适用度不高[17-18]。离子色谱法检测合成甜味剂时对样品基质要求纯净，而食品基质复杂性高，离子色谱法适用度较差。高效液相色谱法是合成甜味剂检测中最为常用的检测方法[19]，同时高效液相色谱法也是《食品安全国家标准 食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定》（GB 5009.263—2016）[20]和《食品中糖精钠的测定》（GB/T 5009.28—2003）[21]规定使用的测定方法。但由于发酵面制品中存在泡打粉等影响因素，存在基质干扰引起的假阳性现象[22]，并且在现行标准中也未有将7种合成甜味剂在高效液相色谱法中同时检测的方法。因此，开发发酵面制品中合成甜味剂同时检测的新方法是目前亟待解决的问题。本研究基于超高效液相色谱-串联质谱法，建立了同时检测发酵面制品的7种甜味剂（糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、三氯蔗糖）的方法。该方法利用了超高效液相色谱柱效高的特点，分离度高，分析速度快，色谱峰更尖锐使得信噪比增大，从而提高分析灵敏度，解决了复杂基质的多组分同时测定的问题。由于UPLC-MS/MS选择性高、灵敏度好，因此在食品监督检测中有广泛的应用前景，并可提高监管效率，为市场上此类食品的安全检测提供参考，具有一定的社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

样品：马拉糕、馒头、花卷、包子共50批，均购于本地超市和商店。

仪器：超高压三重四极杆液质联用仪（型号：Agilent 1290-646，安捷伦科技有限公司）；电子天平（型号：XS205DU，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Multi Reax涡旋振荡器（德国海道夫集团）；超声波清洗器（型号：DTA-42，鼎泰（湖北）生化科技设备制造有限公司）；冷冻离心机（型号：ROTANTA 460R，德国Hettich有限公司）；SYNS00000密理博超纯水机（美国Millipore公司）。

试剂：甲醇、乙腈（色谱纯），均为默克股份有限公司；甲酸（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯），均为Fisher Scientific；亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯），均为西陇科学股份有限公司；微孔滤膜，0.22 μm，天津市科亿隆实验设备有限公司。

对照品：糖精钠（1 mg/mL，中国计量科学研究院，批号：GBW（E）100008-19001）；安賽蜜（质量分数：100%，Stanford Chemicals，批号：ASF-785053-AP171106-18）；甜蜜素（质量分数：99.12%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批号：G140210）；阿斯巴甜（质量分数：99.50%，Stanford Chemicals，批号：ASP-841481-AL171106-06）；阿力甜（1 000 μg/mL，TMstandard，批号：3452006）；纽甜（质量分数：99.14%，Stanford Chemicals，批号：NT-230025）；三氯蔗糖（质量分数：98.41%，Stanford Chemicals，批号：24714XA-14658-036）。

1.2 实验方法

1.2.1 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，负离子模式（ESI-）；离子源温度：350 ℃；雾化气流速：5 L/min；鞘气温度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；雾化器电压：45 psi；毛细管电压：-3 000 V；扫描模式：多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

1.2.2 色谱条件

液相色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）；进样体积：5 μL；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；流动相：A-乙腈、B-纯水，流动相梯度洗脱条件见表1。

1.2.3 对照品储备液的制备

精密称取阿斯巴甜、纽甜、安赛蜜、三氯蔗糖、甜蜜素适量，分别用纯水（纽甜用0.1%甲酸水）配制成1.078 6、1.037 0、1.228 0、1.089 4、0.893 1 mg/mL的单标储备液；精密移取糖精钠标准溶液2 mL，配制成0.760 mg/mL的储备液；阿力甜储备液（质量浓度1 000 μg/mL）；于4 ℃冰箱中保存。

1.2.4 混合标准中间液的配制

精密吸取1.2.3对照品储备液中安赛蜜0.4 mL、糖精钠2 mL、甜蜜素0.2 mL、阿斯巴甜4 mL、三氯蔗糖4 mL、纽甜0.2 mL，阿力甜对照品原液0.04 mL定容至20 mL容量瓶中备用。

1.2.5 混合标准使用液的配制

精密移取上述1.2.4混合标准中间液适量，加入空白基质定容至刻度，摇匀。制得混合标准使用液，含阿斯巴甜：10.786 0 mg/L，纽甜：0.518 5 mg/L，安赛蜜：1.228 0 mg/L，三氯蔗糖：10.894 0 mg/L，甜蜜素：0.446 6 mg/L，糖精钠：3.800 0 mg/L，阿力甜：0.100 0 mg/L。

1.2.6 样品处理

发酵面制品实际样品处理测试：分别称取4份阴性样品各5 g，各精密加入1.2.4中混合标准中间液0.25 mL，分别加入纯水、20%甲醇-水、50%甲醇-水、70%甲醇-水25 mL，分别加入106 g/L亚铁氰化钾溶液和220 g/L乙酸锌溶液2.5 mL，涡旋10 min后定容至50 mL，超声15 min，经7 000 r/min 离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜后，待测。阴性样品处理：取2份阴性样品同法处理，得空白基质。

1.2.7 加标回收检测

称取5 g不同种类发酵面制品阴性样品（代表不同基质基底），分别精密加入混合标准储备液（阿斯巴甜：10.786 0 mg/L，纽甜：0.518 5 mg/L，安赛蜜：1.228 0 mg/L，三氯蔗糖：10.894 0 mg/L，甜蜜素：0.446 6 mg/L，糖精钠：3.800 0 mg/L，阿力甜：0.100 0 mg/L）0.125 mL（低浓度水平）、0.250 mL（中浓度水平）、1.000 mL（高浓度水平），按1.2.6方法进行前处理，按上述优化好的色谱条件操作，对低、中、高3个浓度梯度水平的样品进行6次平行测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别使用5 mg/L各组分标准溶液依次采用直接进样的方式逐一进行测试，在ESI正离子和ESI负离子模式下分别进行MS2扫描，选择了响应力较强的激基缔合体的母离子，而糖精钠和安赛蜜在ESI正离子状态下无法寻找适当的母离子，所以首先使用ESI负离子方法进行测量。Product Ion 模式中选择各组分的最佳子离子和碎裂电压，在MRM模式中选定各组分子离子的碰撞能量。7种甜味剂的质谱MRM参数见表2。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

本研究分别考察了Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）、Agilent Poroshell 120 SB-C8（2.1 mm×100.0 mm，2.7 μm）、Agilent SB-C18（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）3种色谱柱，其高效液相色谱图见图1。通过图1可知，3种色谱柱中，Agilent Poroshell 120 SB-C8峰形有拖尾现象，保留时间为4.6 min，纽甜的峰不尖锐；Agilent SB-C18保留时间为3.4 min，峰有重叠，分离效果差；Agilent Eclipse Plus C18（简称C18）柱峰宽较窄，峰形尖锐，柱效高，分离效果最好。因为C18为全硅胶基键合18个碳的烷烃色谱柱，Agilent Poroshell 120 SB-C8为全硅胶基键合8个碳的烷烃色谱柱，而Agilent SB-C18具有较大的二异丁基（SB-C18） 侧链基团，更适用于低pH值的体系。C18柱适合分离弱极性、中极性相对较弱的化合物，7种合成甜味剂均为极性相对偏弱的化合物，而发酵面制品基本上为弱碱性体系，因此，C18更为适用，本研究选择其作为本体系用色谱柱。

2.2.2 流动相的选择

本研究分别对有机相和水相的选择进行优化。实验选取甲醇和乙腈作为有机相，对两者作为有机相的分离效果进行比较。结果表明，乙腈作为有机相进行检测时，其基线更低，峰形狭窄而尖锐，出峰时间较早，可以得到一个较好的分离效果。主要原因是乙腈在高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）上的吸收小，因此基线较平稳。并且乙腈与水相混合压力较甲醇与水相混合压力更低，同样流速下柱压较低，出峰时间可以更早。对于甜味剂的合成，乙腈的洗脱能力较甲醇更强，可以有更好的分离效果。因此，在该体系中选择乙腈作为有机相流动相较好。以超纯水、摩尔浓度分别为10、30、50 mmol/L乙酸铵的4种水溶液作为水相，乙腈为有机相时，实验比较了7种甜味剂标样的定量离子对响应信号的强弱状况。实验结果表明：水相中乙酸铵浓度越高，化合物的响应就越低，以纯水为水相时响应最高。乙酸铵加入流动相主要是起到调节流动相pH值的作用，本体系测试中对pH值影响不大，乙酸铵的加入反而降低了化合物的响应，因此，本体系选择纯水作为水相流动。综上所述，本研究采用乙腈-纯水作为流动相。7种甜味剂混合标准溶液的定量离子对色谱图见图2。由图2可见，三氯蔗糖和阿斯巴甜的出峰时间有重叠，但可以通过选择不同的子离子来进行定性和定量分析，互不干扰。

2.3 样品前处理的选择

由分析各处理液所得数据可知：当用甲醇浓度过高的甲醇-水溶液处理甜蜜素和安赛蜜时，未检测到相应物质。甲醇浓度过高时，会造成甜蜜素和安赛蜜溶解度降低导致目标检测物的损失，降低体系检测灵敏度。纯水和20%甲醇-水溶液的各组分均能检出，其中纯水的各组分响应值大于20%甲醇-水的响应值。因此，本研究体系采用纯水作为前处理溶液。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性关系、检出限和定量限

将1.2.5的标准使用液用空白基质处理的稀释液稀释成标准系列，再按上述条件进行测试。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得到各组分线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表3。结果表明，7种甜味剂在其对应的线性范围内具有良好的线性关系，相关系数r2值均在0.999 0以上，检出限以S/N=3、定量限S/N=10进行计算，结果满足要求。

2.4.2 回收率和精密度

表4为不同面制品中7种甜味剂的加标回收率和精密度计算结果。表4中，添加量为标样计算数值，测得量为根据本体系优化后检测方法的测试结果，回收率=（测得量/添加量）×100%。由表4可知，各目标化合物标准样品的平均加标回收率为84.5%～96.5%，相对标准偏差（RSD）为1.3%～8.1%。由此可见，本研究方法加标回收测试有良好的加标回收率，具有良好的准确度和精密度。

2.5 实际样品的测定

按照本研究所建立的方法对采购的50批样品（马拉糕5批、花卷10批、馒头20批、包子15批）依次进行检测。其中糖精钠检出6批次，质量分数为1.218～180.015 mg/kg；安赛蜜检出3批次，质量分数为2.749～8.439 mg/kg；阿斯巴甜检出3批次，质量分数為0.734～1.044 mg/kg；其余组分均未检出。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[8]规定，本研究中检测的7种甜味剂均不得检出，表明在市场中流通的发酵面制品存在非法添加甜味剂的现象，需要加大对此类产品的监管力度。

3 结论

本研究建立了一种利用UPLC-MS/MS同时检测发酵面制品中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的方法，并对仪器条件和前处理方法进行了优化，前处理方法简便，分析体系测试分析时间在6 min以内，体现该方法的快捷高效。研究结果显示：该方法的线性关系良好，所有相关系数r2值均大于0.999 0，检出限为3.0×10-6～3.0×10-4 g/kg，定量限为1.0×10-5～1.0×10-3 g/kg。本研究针对发酵面制品体系不同基质进行加标回收检测，平均回收率为84.5%～96.5%，相对标准偏差为1.3%～8.1%。该方法在复杂基质基底中有着良好的加标回收率，未出现明显干扰，将其用于快速检测发酵面制品中的7种甜味剂，可大大提高检测的准确性，为安全监管发酵面制品中的甜味剂的检测提供了技术支持，具有很好的社会效益。

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Simultaneous determination of 7 sweeteners in fermented flour

product by UPLC-MS/MS

JIANG Yeling1， HOU Xuhe*2， LYU Baoying2

（1.Guilin Food and Drug Quality Inspection Institute， Guilin 541200， China; 2. Medical School，Guangxi

University of Science and Technology， Liuzhou 545005， China）

Abstract：This study adopted ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）to detect 7 sweeteners（sodium saccharin， aspartame， acesulfame-K， neotame， alitame， saccharin sodium and chlorinated sucrose）in fermented dough products simultaneously. The samples were pre-treated by mechanical shaking， ultrasonic extraction， precipitation of proteins with ferricyanide potassium and zinc acetate， and filtration through a 0.22 μm membrane. The Agilent Eclipse Plus C18 column（2.1 mm ×50.0 mm， 1.8 μm）was washed with a gradient of acetonitrile-water. Multiple reaction monitoring（MRM）mode was used for segmented collection under negative electrospray ionization（ESI-）. The results showed that the seven sweeteners had good linear relationships within the concentration range of 0.01 to 0.50 μg/mL， with correlation coefficients r2 greater than 0.999 1. The detection limit was 3.0 × 10-6 to 3.0 × 10-4 g/kg and the quantitation limit was 1.0 × 10-5 to 1.0 × 10-3 g/kg. The average recoveries of the samples were 84.5% to 96.5% with relative standard deviations of 1.3% to 8.1%（n=6）. The experiment results show that this method is fast， accurate， reproducible， and can be widely applied to the detection of various fermented flour products.

Key words： sweeteners; fermented flour products; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

（责任编辑：于艳霞 罗小芬）