自噬在牙源性干细胞衰老中作用的研究进展

［摘要］牙源性干细胞（DSCs）具有很好的自我更新及多向分化的潜能，是再生医学和组织工程领域重要的种子细胞。但DSCs衰老导致的增殖分化能力及细胞生理功能的衰退严重阻碍了其应用。自噬通过维持细胞的代谢稳态，在DSCs的衰老过程中发挥着重要的调节作用。本文从自噬对DSCs 衰老的作用以及抗衰老药物对DSCs自噬的影响作一综述，以期为深入探索DSCs 衰老的研究及防治老年病建立基础。

［关键词］自噬；牙源性干细胞；衰老；抗衰老

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.05.020

Advancements in Understanding Autophagy's Role in Dental Stem Cell Aging

Zhan Luoning，Li Chunwang，Zuo Linjing，Gao Wenjia，Xie Xiaoyu，Li Yi**

Hospital of Stomatology，Jilin University，Changchun130021

**Corresponding author：Li Yi，email：lyi99@jlu.edu.cn

［Abstract］Dental stem cells（DSCs） possess remarkable potential for self-renewal and differentiation in multiple directions，making them invaluable seed cells in the domains of regenerative medicine and tissue engineering.However，their utility is impeded by senescence，a process that diminishes their capacity for cellular proliferation，differentiation，and physiological function.Autophagy，a highly conserved catabolic process within cells，plays a pivotal role in the aging of odontogenic stem cells by maintaining cellular metabolic homeostasis.By actively investigating the mechanisms underlying autophagy in DSCs aging and exploring strategies to delay senescence，novel and rational treatment approaches can be developed for regenerative medicine.This article provides a comprehensive review of the impact of autophagy on the senescence of DSCs and the influence of lifespan extension on autophagy in odontogenic stem cells.The objective is to establish a solid foundation for future research on DSCs senescence and the prevention and treatment of age-related conditions.

［Key words］Autophagy;Dental stem cells;Aging;Anti-aging

牙源性干细胞（Dental stem cells，DSCs）是具有自我更新和多向分化潜能的间充质干细胞，如成骨分化、软骨分化、成脂分化、类牙体硬组织分化、促血管分化及肌源分化等，在再生医学与组织工程领域中发挥着重要作用［1-2］。具有来源丰富、低免疫原性和无伦理限制等优点，根据来源，DSCs有牙髓干细胞 （Dental pulp stem cells，DPSCs）、牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、牙龈干细胞（Gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）、根尖牙乳头干细胞（Stem cells from apical papilla，SCAPs）、牙囊干细胞（Dental follicle stem cell，DFSCs）以及乳牙干细胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）［3］。细胞衰老会降低DSCs的增殖、克隆形成和分化潜力，以及免疫特性、细胞迁移和黏附能力，阻碍其应用［4］。自噬是一种高度保守的分解代谢过程，通过降解受损分子和失调细胞器以及减轻病理和感染引起的应激，维持细胞代谢稳态，在干细胞衰老的过程中发挥着重要的调节作用［5］。本文关注于自噬在DSCs衰老中作用的研究进展，并对其作一综述。

1自噬的概况

自噬是一种为了维持细胞内环境稳态而去除受损细胞器、聚集的蛋白质和入侵病原体的高度保守的胞内分解代谢过程［6］。在自噬过程中，细胞内受损细胞器和大分子被一种双膜囊泡细胞器—自噬体吞没，随后与溶酶体融合形成自溶酶体，其中的水解酶降解被捕获物质，产物则通过外排通透酶的作用释放回细胞质供其他代谢途径利用［7］。因此，自噬与生长、发育、疾病、衰老等过程密切相关。

1.1自噬的类型

根据分解底物被输送到溶酶体降解过程的不同，自噬的类型分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA）。①巨自噬是目前研究最为深入的经典形式，简称为自噬。其最初被认为是一种非选择性过程，自噬体通过靶向胞内受损大分子或亚细胞器，运输到溶酶体降解［8］。但随着选择性自噬受体如自噬相关基因的相互作用模体（Atg8-family interacting motif，AIM），或人微管相关蛋白轻链3相互作用域（Microtubule associated proteins interacting region，LIR）的发现，自噬逐渐被认为是一种高度选择性的细胞清除途径，根据溶酶体降解的特定底物进行分类，主要包括聚集自噬（蛋白质聚集体）、脂肪自噬（脂肪颗粒）、线粒体自噬（线粒体）、内质网自噬（内质网）、糖噬（糖原）和异体自噬（病原微生物）等［8-9］。 ②微自噬是指溶酶体限制性膜直接内陷，包裹衰老或变异蛋白质及受损细胞器等细胞内物质，进而被溶酶体内各种溶解酶分解代谢的过程［10］。③CMA是一种高度选择性的溶酶体依赖性降解过程。协助蛋白跨膜转运的分子伴侣蛋白，即热休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）特异性识别胞内具有 KFERQ 五肽序列片段的自噬底物，并与其他分子伴侣蛋白形成复合体，靶向到溶酶体表面与LAMP2A受体结合并转运到溶酶体腔内进行降解［11］。

1.2自噬的过程

自噬的发生过程可分为5个阶段：起始、囊泡成核、囊泡延伸、囊泡融合、底物降解。①起始阶段：机体接收到自噬诱导信号如饥饿、氧化应激及病原体入侵后，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（Mammalian target of rapamycin-1，mTOR-1），激活单磷酸腺苷活化激酶（Adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase，AMPK）促使自噬启动蛋白1 （Unc-51-like kinase 1，ULK1）复合物易位至内质网，激活磷脂酰肌醇3激酶3（Phosphatidylinositol 3 kinase 3，PIK3C3）复合物，促进自噬体膜的形成并启动自噬的发生［12-13］。②囊泡成核：自噬相关蛋白Beclin 1在自噬囊泡成核阶段发挥着重要角色。Beclin 1-PIK3C3复合物包括hVPS34、Beclin 1和p150蛋白及一系列相关蛋白如Bcl-2、VPS15、UVRAG、BIF-1、Atg14L等，募集胞质中的蛋白质和脂质合成自噬体膜［14］。③囊泡延伸：自噬相关蛋白质聚集到自噬前体的双层膜外侧形成复合物，控制双层膜的曲度并募集游离膜使膜不断延伸，同时，游离于细胞质的LC3- I与磷脂酰乙醇胺结合，转位到自噬体膜上，转化成LC3- Ⅱ，参与前自噬囊泡的延伸［7］。④囊泡融合：自噬囊泡与溶酶体在RAB蛋白、SNARE蛋白和HOPS复合物的辅助下通过微管骨架连接，溶酶体酶降解自噬囊泡的内膜，形成自噬溶酶体［7，15］。⑤底物降解：LC3-Ⅱ与含有LIR的自噬受体，如p62等结合后，自噬溶酶体中的溶酶体酶使内容物降解成脂肪酸、氨基酸和核酸等小分子被细胞循环再利用［16］。

2自噬在DSCs衰老中的作用

尽管应用DSCs的干细胞疗法已被证明是治疗各种损伤和疾病的有效疗法，但DSCs衰老却严重影响了其在临床复杂环境中的后续治疗效果［17］。DSCs在体外长期培养后，会出现增殖能力下降、细胞周期阻滞、衰老相关蛋白p53/p21高表达等衰老相关迹象［17-18］。因此，为获取足够数量的健壮细胞或延长体外细胞扩增，探索衰老对DSCs生命周期的影响则显得尤为重要。在细胞衰老过程中，β-半乳糖苷酶高表达、活性氧积累、DNA损伤、线粒体功能障碍、代谢改变、表观遗传修饰或端粒酶异常等均发挥着不可小觑的影响［19］。但值得注意的是，越来越多的证据表明，自噬的发生在衰老干细胞中比其他类型细胞更加频繁［20］。这或许是一个减弱DSCs衰老的新思路、新靶点。目前自噬在DSCs衰老中作用的研究大多聚焦于PDLSCs、DPSCs及DFSCs。

2.1自噬在PDLSCs衰老中的作用

细胞自噬是一个连续的过程，从自噬体形成到降解的过程则称为自噬通量［21］。将PDLSCs从第二代传代至第十五代，自噬溶酶体的数量减少，这种趋势的变化并不是其降解导致的，而是长期传代后的细胞自噬通量被阻断的结果［16］。此外，参与自噬体延伸的LC3-Ⅱ是目前自噬体和自噬通量检测中最广泛使用的标志物，主要定位于自噬体的外膜和内膜上，其表达水平随着自噬体与溶酶体融合及随后被溶酶体降解而降低［22］。当溶酶体的形成受到抑制后，LC3-Ⅱ在年轻一代的PDLSCs中显著积累，而在第十五代PDLSCs中的表达则未受影响，除此之外，随着传代次数的增加，细胞内表征降解底物的p62蛋白逐渐升高，而Atg7和Beclin-1等自噬相关蛋白的表达则逐渐下降，表明随着细胞传代的增加，自噬体的形成受到了显著抑制，而非自噬溶酶体的降解增加［16］。

2.2自噬在DPSCs衰老中的作用

DPSCs中的自噬活性是确保亚细胞成分周转和降解的基本机制，但自噬在DPSCs衰老中的确切作用仍然难以捉摸［23-24］。线粒体自噬常见于年轻的牙髓细胞中［25］。该途径避免了牙髓细胞中溶酶体内碎片的积累，从而维持正常生理功能，但在衰老的牙髓细胞中，脂褐素在溶酶体内的进行性累积标志着溶酶体活性降低，自噬被显著抑制，细胞活力和分泌功能严重受损［23，26］。衰老的DPSCs中可以观察到大量的自噬囊泡，自噬相关蛋白Atg5、LC3-1A/1B及Beclin-1和细胞间黏附分子增加，而过氧化物酶体增殖物激活的受体γ和血红素加氧酶1的表达下降［27］。其中，过氧化物酶体增殖物激活的受体γ可以激活衰老DPSCs中的线粒体活性和细胞活力，并诱导血红素加氧酶1和自噬相关蛋白的表达，降低衰老DPSCs中的炎症因子的表达，在DPSCs的生命周期内通过调节自噬来维持牙髓生理稳态［28］。但总的来说，诱导自噬通常与抑制细胞衰老有关，并且对细胞的持续存活非常重要。

2.3自噬在DFSCs衰老中的作用

将DFSCs体外扩增至第十二代时便会出现衰老迹象，AMPK活性严重受损，但自噬相关蛋白LC3 a / b Ⅱ 与LC3 a / b I的比值却未见明显变化［29］。直接抑制自噬蛋白Atg12的表达可以促进DFSCs的衰老，有趣的是，无论激活还是下调AMPK的活性均可以抑制DFSCs中的自噬并加剧DFSCs的衰老［20，29］。

3改善自噬，抵抗DSCs衰老的策略

3.1通过褪黑素改善自噬，抵抗DSCs衰老

褪黑素可以通过激活抗氧化防御系统，抑制间充质干细胞的衰老，维护干细胞自我更新及分化潜能［30］。褪黑素可以激活PDLSCs中的褪黑素受体，从而下调PI3K/Akt/mTOR信号通路来恢复细胞自噬，并减弱PDLSCs的衰老［17］。此外，褪黑素还可以通过SIRT2依赖性途径，减弱过氧化氢H2O2刺激的p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化，降低了衰老相关蛋白p16的表达，保护间充质干细胞免受H2O2诱导的过早衰老［31］。

3.2通过二甲双胍改善自噬，抵抗DSCs衰老

二甲双胍是AMPK和自噬的诱导剂，可以显著抑制细胞衰老［32］。但最近的一项研究表明，二甲双胍激活了AMPK后，自噬受损，加剧了DFSCs的衰老，这可能是由于长期应用二甲双胍治疗后，AMPK的激活诱导了细胞内葡萄糖的消耗，降低了DFSCs中的NAD+/NADH比值，诱发了线粒体功能障碍，从而加剧了细胞的衰老［29］。PDLSCs暴露于H2O2诱导的氧化应激时，二甲双胍可降低 反应活性氧水平，增强抗氧化能力［33］。另外，二甲双胍预处理可以抵御氧化应激下PDLSCs的衰老，而加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可逆转二甲双胍的效应，说明二甲双胍对PDLCs的保护作用可能是通过自噬介导的［34］。二甲双胍也可以通过调控自噬相关AMPK/mTOR信号通路下调微RNA miR-34a-3p，上调钙结合蛋白39，从而缓解DPSCs的衰老［32］。因此，二甲双胍对DSCs衰老的抑制作用表现出了其作为DSCs衰老治疗靶点药物的优良潜力。

4小结与展望

不同DSCs衰老的机制和对环境改变的反应不尽相同，自噬参与了DSCs衰老过程的调节，但相关性研究并不深入，而抗衰药物诱导自噬在DSCs衰老过程中系统性的作用机制仍不明朗。深度探索自噬在维持DSCs功能并延缓衰老过程的作用机制，有利于为科研人员提供较为全面的信息，也为促进再生医学的发展提供新靶点、新策略。

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（2023-03-13收稿）