不同溶剂对蒙早苦荬菜活性物质提取的影响

意如乐 格根图 贾玉山 王志军 郝俊峰 建 原

（1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院 农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室 草地资源教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区林业和草原监测规划院，内蒙古 呼和浩特 010020）

苦荬菜又称山莴苣、苦麻菜等，是菊科（Compositae）莴苣属（Lactuca）草本植物。苦荬菜中含有大量的粗蛋白、粗脂肪、纤维素等[1]。研究表明，苦荬菜鲜嫩多汁，富含黄酮类、脂类、萜类等活性物质，具有清热解毒、消炎止痛、抗氧化、抗衰老等功效[2-4]。近代医学证实，苦荬菜对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌以及白血病细胞均具有不同程度的抑制效果[5]。苦荬菜水煮液外敷对刀伤和烧伤具有一定的疗效。苦荬菜中含有蜡醇、酒石酸、胆碱等多种成分，味略苦，但经过加工处理，食之别有风味。苦荬菜具有较好的药理作用以及较高的饲用价值，其粗蛋白含量与紫花苜蓿相近[6]。苦荬菜活性物质的提取方法有浸提法、索氏提取法和超声波/微波辅助有机溶剂提取法等，提取溶剂主要为乙醇和水的混合溶剂。罗伟强等[7]、曾文辉等[8]比较了3种溶剂对苦荬菜茎黄酮类物质提取率，发现水提法提取率最低，而乙醇溶液提取率较高。袁文静等[9]和石同同等[10]优化了超声波提取总三萜和总黄酮的工艺条件。但目前对苦荬菜活性成分的提取鉴定以及药理作用的研究多集中于全株，关于不同部位活性成分的分布特征及时空分布尚未见报道。本研究通过利用不同溶剂提取苦荬菜不同部位活性物质，为苦荬菜活性成分开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蒙早苦荬菜为内蒙古农业大学培育的饲草品种，于2019 年5 月15 日在内蒙古农业大学牧草基地播种，每隔2 d 浇1 次水。2019 年6 月5 日选取大小均匀、新鲜无病虫害的植株，除根、茎后在阴暗处室温阴干，粉碎，分别装入3个自封袋。

1.2 试剂与仪器

Folin-Ciocalteu 试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、没食子酸标准品以及芦丁标准品均购自上海源叶科技有限公司，甲醇、乙酸乙酯、乙醇和六氰基亚铁酸钾均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

超声波清洗器购自德国Elma公司，万分之一天平购自瑞士Mettler-Toledo公司，粉碎机购自青岛微纳粉体机械有限公司，紫外分光光度计购自英国Biochrom公司。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 样品提取

根据本课题组前期进行单因素和正交试验得到的优化条件[1]，采用超声波辅助提取技术研究不同溶剂对蒙早苦荬菜中抗氧化性成分的影响。准确称取1.0 g蒙早苦荬菜不同部位（根、茎、叶）粉末于锥形瓶中，分别加入15 mL 蒸馏水、60%乙醇、乙醇（99.7%）、甲醇和乙酸乙酯混匀，于70 ℃超声波清洗器中超声提取30 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液，定容至60 mL，得到滤液于4 ℃保存，每个试验平行3次。

1.3.2 主要活性物质

1.3.2.1 总黄酮

参照Yi 等[11]的方法测定，略作修改。采用AlCl3-NaOH-NaNO2法，取2.0 mL 不同浓度的芦丁标准品溶液与0.4 mL 5% NaNO2溶液反应6 min，加入0.4 mL 10% AlCl3溶液摇匀，反应6 min，加入4 mL 4% NaOH溶液和3.2 mL 蒸馏水混匀，在室温内反应25 min，于紫外分光光度计510 nm处测定吸光度值。

取不同溶剂提取液0.2 mL，加溶剂至2.0 mL，按标准曲线的方法测定不同溶剂样品提取液中的总黄酮吸光度值为Ai，样品溶剂代替样品做空白，蒸馏水代替NaNO2溶液、AlCl3溶液和NaOH 溶液的吸光度值为Aj，3次重复，根据标准曲线得出不同溶剂提取物中的总黄酮质量浓度。标准曲线：y=0.011 5x-0.076 7，R2=0.999 0。

1.3.2.2 总酚

参照Naidu等[12]的方法测定，略作修改。采用Folin-Ciocalteu 法，分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 125 mg/L 没食子酸标准品溶液于10 mL 试管中，加入甲醇至4 mL，分别加入0.5 mL Folin-Ciocalteu 试剂混匀，5 min 后加入1.5 mL 20% NaCO3溶液，蒸馏水定容至10 mL，室温避光反应30 min，在765 nm处测定吸光度值。

取不同溶剂提取液0.1 mL，加入溶剂至2.0 mL，按标准曲线的方法测定不同溶剂样品提取液中的总酚吸光度值Ai，样品溶剂代替样品做空白，蒸馏水代替Folin-Ciocalteu 试剂测定的吸光度值为Aj，根据标准曲线计算不同溶剂提取液中总酚浓度，3 次重复。标准曲线：y=0.032 6x-0.026 1，R2=0.999 2。

1.3.3 抗氧化性测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除力

参照Huang 等[13]的方法测定，略作修改。准确称取10 mg DPPH 标准品，溶于无水乙醇溶剂中，超声5 min后充分振荡，定容于100 mL 的容量瓶中配成0.1 g/L DPPH 储备液，置于冰箱保存。取2 mL 不同质量浓度（1.0～4.0 g/L）的样品提取液，分别加入0.1 g/L 的2 mL DPPH 溶液，摇匀，在黑暗处放置30 min，于517 nm 处测定其吸光度值，计算DPPH 自由基清除率，并用SPSS分析软件计算其半抑制浓度（IC50）。

1.3.3.2 羟自由基消除能力

参照Aidi 等[14]的方法测定，略作修改。在试管中依次加入一定质量浓度的FeSO4溶液以及不同浓度的样品提取液和过氧化氢溶液、水杨酸溶液，在波长510 nm处测定其吸光度，根据标准曲线计算羟自由基清除率。

1.3.3.3 还原能力

参照Juntachote 等[15]和Terpinc 等[16]的方法测定，略作修改。将不同质量浓度（1.0～4.0 g/L）的样品提取液1 mL 与磷酸盐缓冲液（0.5 mL，0.2 mol/L，pH 值6.8）和六氰基亚铁酸钾（2.5 mL，1%）混合。加入20%的2.5 mL 三氯乙酸溶液。25 min 后，在740 nm 处测定吸光度，吸光度值越大表示提取物的还原能力越强。

1.3.3.4 ABTS自由基消除能力

参照Chen 等[17]的方法测定，略作修改。以维生素C为阳性对照，采用分光光度计在734 nm处测定不同质量浓度（1.0～4.0 g/L）样品提取液的吸光度。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2016软件进行整理，Origin 2021软件作图，SPSS 24 软件进行方差分析，使用One-way ANOVA分析数据间的差异显著性，LSD法多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取下蒙早苦荬菜根、茎、叶中总黄酮和总酚含量分析（见表1～表3）

表1 不同溶剂提取下蒙早苦荬菜根部总黄酮、总酚提取含量 单位：mg/g

由表1可知，蒙早苦荬菜根部在5种不同提取溶剂的提取下，总黄酮提取量为6.98～7.65 mg/g，其中乙酸乙酯和乙醇的提取物中总黄酮含量较高，分别为7.58、7.65 mg/g；总酚提取量为2.67～3.92 mg/g，其中甲醇和60%乙醇提取物的总酚含量较高，分别为3.92、3.46 mg/g。

由表2可知，蒙早苦荬菜茎在5种不同提取溶剂的提取下，总黄酮提取含量为6.56～6.89 mg/g，其中乙酸乙酯和水提物的提取含量较高，分别为6.82、6.89 mg/g；总酚提取含量为1.88～3.36 mg/g，水提物和60%乙醇的提取含量较高，分别为3.23、3.36 mg/g。

表2 不同溶剂提取下蒙早苦荬菜茎中总黄酮、总酚提取含量 单位：mg/g

由表3可知，蒙早苦荬菜叶片在5种不同提取溶剂的提取下，总黄酮提取含量为8.35～10.22 mg/g，其中乙醇和60%乙醇总黄酮提取含量较高，分别为9.67、10.22 mg/g；总酚提取含量为2.14～10.69 mg/g，其中60%乙醇和水提物的提取含量较高，分别为10.69、6.28 mg/g。

研究表明，蒙早苦荬菜3个部位在5种不同提取溶剂的提取量比较中，使用甲醇提取茎中总黄酮含量最低，值为6.61 mg/g；使用乙醇提取茎中总酚含量为最低，为1.88 mg/g；使用60%乙醇提取叶片中总黄酮含量和总酚含量最高，分别为10.22、10.69 mg/g。蒙早苦荬菜各个部位的总黄酮和总酚含量依次为叶＞根＞茎。在各个部位中叶片的活性成分含量最高，可选择叶片作为材料，研究不同溶剂提取物的抗氧化性。

2.2 蒙早苦荬菜在不同溶剂叶提取物的DPPH 自由基清除率（见图1）

图1 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物的DPPH自由基清除率

由图1可知，当样品质量浓度在1.0～4.0 g/L之间，不同溶剂提取物对DPPH 自由基均具有不同程度的清除能力，且与DPPH 自由基清除能力呈量效关系。蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物清除DPPH 自由基的能力随样品浓度增加而增强，当质量浓度达3.0 g/L时，变化趋于平缓。60%乙醇提取物的消除能力最强，其次为乙醇提取物，水提物的DPPH 自由基清除率最低。在样品质量浓度为1.0～4.0 g/L 范围内，水提物的DPPH 自由基消除率仅为16.16%～59.11%，而60%乙醇提取物的DPPH 自由基清除率在42.98%～88.65%。根据IC50值对不同溶剂叶提取物的DPPH自由基清除能力排序为60%乙醇＞乙醇＞甲醇＞蒸馏水＞乙酸乙酯。60%乙醇和乙醇溶液对DPPH自由基的清除能力优于其他溶剂。

2.3 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物羟自由基消除能力（见图2）

图2 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物对羟自由基消除能力

由图2可知，样品质量浓度在1.0～4.0 g/L之间，羟自由基对所有溶剂均具有不同程度的消除能力，蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物消除羟基自由基的能力随样品浓度增加而增强，不同溶剂提取物浓度与羟自由基消除能力呈量效关系，当样品质量浓度达2.5 g/L 时，变化趋于迟缓。依据IC50值对不同溶剂叶提取物对羟自由基消除能力排序为60%乙醇＞蒸馏水＞甲醇＞乙醇＞乙酸乙酯，表明60%乙醇溶液对羟自由基的消除能力最优。

2.4 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物还原能力（见图3、表4）

图3 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物的还原能力

表4 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物的还原能力分析

由图3 可知，蒙早苦荬菜不同溶剂提取物间的还原能力存在一定差异，但不同溶剂提取物的还原能力与样品浓度存在较好的量效关系。样品的质量浓度为1.0～4.0 g/L 时，60%乙醇提取物总还原能力最强（IC50值为2.58 g/L），而水提物还原能力最弱，在线性范围内，水提物的吸光度值仅为0.07～0.23。依据IC50值对不同溶剂叶提取物的还原能力排序为60%乙醇＞乙醇＞乙酸乙酯＞甲醇＞蒸馏水。研究表明，乙醇水溶剂提取物还原能力强于蒸馏水溶剂，其中60%乙醇溶剂还原能力最佳。

由表4可知，在试验浓度范围内5种样品吸光度值均与其质量浓度呈现正相关的线性关系，通过Excel拟合曲线得到回归方程。研究表明，60%乙醇提取物及乙醇提取物均有较好的还原能力，蒸馏水提取物还原能力最弱；从线性关系分析，甲醇提取物的还原力则更加稳定。

2.5 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物ABTS 自由基清除能力（见图4）

图4 蒙早苦荬菜不同溶剂叶提取物的ABTS自由基清除能力

由图4可知，样品质量浓度在1.0～4.0 g/L之间，60%乙醇提取物、乙醇提取物和甲醇提取物清除ABTS 自由基的能力随样品质量浓度增加而增强，其IC50值分别为1.84、2.46、4.19 g/L，水提物消除ABTS自由基的能力最弱，IC50值为6.68 g/L。不同溶剂提取物质量浓度与ABTS自由基消除能力呈较好的量效关系。依据IC50值发现，60%乙醇提取物对清除ABTS自由基的能力最强。

2.6 不同溶剂提取物的抗氧化活性与蒙早苦荬菜叶中活性成分含量的相关性分析（见表5）。

表5 不同溶剂提取物的抗氧化活性与蒙早苦荬菜叶中活性成分含量的相关性分析

由表5可知，蒙早苦荬菜不同溶剂提取物的DPPH自由基清除率与总黄酮含量呈显著正相关（P＜0.05），羟自由基清除率与总酚含量呈显著正相关（P＜0.05），还原能力与总黄酮含量呈极显著正相关（P＜0.01），ABTS 自由基清除率与总黄酮呈极显著正相关（P＜0.01）。

3 讨论

吴奇等[18]、荣荣[19]研究表明，对植物提取物抗氧化性起主要作用的物质包括多酚类和黄酮类。本研究选取5种不同极性的溶剂对蒙早苦荬菜不同部位的活性物质进行提取，结果发现，与其他4种溶剂相比，60%乙醇提取茎中的总酚以及叶中的黄酮和总酚含量最高，原因可能是在相同条件下乙醇水溶液能够更好地溶解酚类化合物[20]。赵玉红等[21]研究比较了几种不同溶剂对“鲁赫”刺蔷薇叶中活性成分的提取效果，得出最佳提取溶剂为60%乙醇，与本研究结果相似。张福娟等[22]以70%甲醇和70%丙酮作为溶剂提取绿豆皮中活性物质，结果发现，丙酮对绿豆皮黄酮类提取效果最佳。因此，不同植物材料需要不同极性提取溶剂才可最大限度地提取出活性物质，不同极性提取溶剂对不同植物酚类化合物的影响效果较大。

本研究发现，在一定质量浓度范围内，不同溶剂叶提取物均具有较好的抗氧化能力，且抗氧化能力随着溶剂浓度的增加而增强。研究表明，与只使用水提取相比，用乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙腈等有机溶剂与水混合提取可大幅提高植物活性成分的抗氧化性[23-26]。ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、铁离子还原力及羟自由基清除能力等体外化学分析方法常被用于测定植物提取物中的抗氧化性。DPPH自由基是一种较好的比较抗氧化性的指标，其原理为DPPH 被抗氧化剂的氢原子还原之后，DPPH由紫变黄。研究表明，可以通过测量517 nm 处吸光度减少量，确定植物提取物的抗氧化能力[27]。本研究发现，60%乙醇提取物在浓度1.0～4.0 g/L范围内，DPPH 自由基清除能力最强，其次是乙醇提取物，乙酸乙酯提取物清除能力最弱，与张露[28]研究结果一致。在本研究中，DPPH自由基清除能力与蒙早苦荬菜中的总黄酮和总酚含量的相关系数（r）分别为0.953、0.660，表明蒙早苦荬菜中主要的抗氧化剂为黄酮类，其次为酚类。

本研究发现，与其他溶剂相比，60%乙醇叶提取物褪色效果最明显，乙酸乙酯提取物褪色效果最差，表明60%乙醇提取物具有更高的清除羟自由基能力。对活性物质含量与羟自由基消除能力作相关性分析，结果显示，羟自由基与总酚含量的r值为0.916，而与总黄酮含量的r值仅为0.310，虽然不同溶剂叶提取物中总酚含量偏低，但具有高度的抗氧化性，从而显示出较强的抗氧化能力。

4 结论

本研究结果表明，蒙早苦荬菜各个部位总黄酮与总酚含量排序为叶＞根＞茎，蒙早苦荬菜活性物质提取溶剂中最佳的是60%乙醇。蒙早苦荬菜中活性物质的含量与其抗氧化性之间呈良好的量效关系。