血清HCO3-酶法检测试剂改良路径的比较研究*

黄 洁,崔 婷,张炳峰,张洁心△

1.芜湖市中医医院检验科,安徽芜湖 241000;2.南京医科大学第一附属医院检验学部,江苏南京 210029

血液中二氧化碳(CO2)主要以碳酸氢盐(HCO3-)形式存在。由HCO3-和碳酸(H2CO3)组成的缓冲液体系维持机体酸碱平衡和血液pH值。任何导致pH值超出范围的病理生理状态都属于酸碱平衡紊乱[1]。流行病学研究发现,血清HCO3-浓度与高血压、急性肾损伤进展、恶性肿瘤相关死亡率、心力衰竭有关[2-6]。它还与糖耐量受损、糖尿病相关高风险因子之间存在相关性,并可能成为糖尿病预防相关研究的新靶点[7-8]。因此,及时准确地获得血清HCO3-浓度对于动态观察机体酸碱平衡状态以及疾病鉴别诊断和预后判断尤为重要。

血清HCO3-浓度可通过血气分析仪或者生化分析仪进行检测。为了获得更加准确的结果,临床医生多数选择留取静脉血进行生化检测。磷酸烯醇式丙酮酸羟化酶法(PEPC法)是目前临床生化实验室应用最为广泛的检测血清HCO3-浓度的方法。循环酶法(CEM法)是近几年新兴的改良酶法。本课题组前期报道了检测前环境因素可干扰血清CO2浓度检测[9]。考虑到生化试剂本身性能也会对标本检测结果产生重要影响,本研究通过比较两种方法学试剂的开瓶稳定性和试剂组分有效性这两个方面,进一步评估改良酶法试剂质量,探讨未来临床应用价值。

1 材料与方法

1.1仪器及试剂 Beckman Coulter公司AU5800 型全自动生化分析仪。CEM法试剂1(贝克曼库尔特公司,以下称“C1试剂”)、CEM法试剂2(澳林生物科技有限公司,以下称“C2试剂”)。PEPC法试剂(迈克生物股份有限公司,以下称“P试剂”)。CEM法试剂所含供氢体为乙酰基-还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(AcNADH),PEPC法试剂所含供氢体为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),其余试剂成分同。C1试剂含AcNADH为1.6 mmol/L,C2试剂含AcNADH为0.5 mmol/L。P试剂含NADH为0.5 mmol/L。反应体系按照试剂盒说明书设置。质控品为美国伯乐公司的生化低值质控品(批号:26461)和高值质控品(批号:26462)。

1.2方法

1.2.1试剂开瓶稳定性 参考美国临床实验室标准化协会EP25-A文件[10]结合本实验室每个月标本量和试剂使用量实际情况制定。C1试剂和P试剂敞口置于生化分析仪内4 ℃保存。每天早上8:30检测试剂空白,连续检测20 d,计算各试剂当天空白吸光度值与第一天空白吸光度值的检测偏倚(BA)。

1.2.2试剂组分有效性 参考美国临床实验室标准化协会EP5-A3文件[11]结合本实验室每个月标本量和试剂使用量实际情况制定。将低值、高值质控品复溶,各分装20份,置于4 ℃密封保存。每天各取1份,使用C1试剂、C2试剂和P试剂分别进行检测,连续检测20 d,计算检测值的前n天变异系数(CV)。

2 结 果

C1试剂和P试剂开瓶后20 d内空白吸光度值BA均呈现下降趋势。其中,C1试剂空白吸光度值BA为-1.47%±3.19%,最大变化-11.3%;而P试剂空白吸光度值BA为-19.03%±6.01%,最大可达-28.35%。见图1。

使用C1试剂、C2试剂和P试剂连续检测低值、高值质控品20 d。3个试剂的检测值前n天CV均呈增高趋势。将最大CV按从大到小排列依次为P试剂(11.43%和13.64%)、C2试剂(6.05%和7.48%)和C1试剂(4.92%和3.72%)。P试剂的低值质控品检测值前n天CV为6.50%±2.90%,高值质控品检测值前n天CV为6.34%±3.60%;C2试剂的低值质控品检测CV为3.71%±1.19%,高值质控品检测CV为3.47%±2.22%。加大了底物AcNADH浓度的C1试剂,其低值质控品检测CV为3.62%±1.18%,高值质控品检测CV为2.35%±1.27%。见图2。

注:A为检测低值质控品;B为检测高值质控品。

3 讨 论

NADH是检测血清HCO3-浓度的生化试剂中的重要供氢体,其在特定波长处有吸收峰。当NADH被中间产物氧化为无吸收峰的NAD+,反应液吸光度值的降低与血清中HCO3-的浓度成正比[12]。由于试剂敞口存放在生化分析仪的试剂托盘上,空气中的 CO2 也可缓慢与试剂中NADH成分发生非特异性反应,导致试剂空白吸光度值随着试剂敞口时间延长而发生下降[13-14]。CEM法将NADH修饰成AcNADH,并增加一个独立的AcNADH循环再生酶促反应体系,即添加葡萄糖组分作为供氢体,在葡糖糖脱氢酶的催化下将氧化型AcNAD再次还原成AcNADH,从而形成闭环。理论上,基于改良方法学的生化试剂能克服环境因素影响,确保开瓶稳定性[15]。本研究数据证实CEM法试剂的开瓶稳定性较PEPC法试剂有显著提升。

生化酶法检测血清HCO3-通常采用两点速率法,即通过测定单位时间内吸光度的降低值来算得血清HCO3-浓度。此法一定程度上能抵消空白吸光度值波动所致的不良影响[16-17]。底物浓度是决定反应速度最重要因素之一。只有当底物浓度足够大时,酶促反应速度才能保持恒定,使反应处于零级反应期,此时酶促反应速度和酶浓度存在线性关系。随着反应时间增加,底物浓度快速降低,酶促反应速度逐渐减慢,反应达到非线性期[18]。两点速率法的吸光度读点区设定在线性期。若底物浓度不足,零级反应期变短,读点区在零级反应期之外,检测线性范围将变小,检测精密度变差[19-22]。本研究结果表明,当提高改良酶法试剂中AcNADH浓度至三倍,可更加延长维持试剂成分有效性,全面提高批间精密度。因此,在采用CEM法的基础上进一步加大底物AcNADH浓度可保证改良酶法试剂质量,提高实验室检验水平,具有广阔的临床推广和应用前景。