基于数据挖掘及网络药理学分析辛夷-蝉蜕药对治疗儿童过敏性鼻炎的分子机制

周 珊，普 芳，张值伟，赵 兰，唐 彦

（云南中医药大学第一临床医学院，云南 昆明 650051）

过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）在现代医学中被认为是机体接触变应原后主要由特异性免疫蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导的鼻黏膜非感染性炎症[1]，故又称之为变应性鼻炎，在中医学中属于“鼻鼽”范畴，其具有发病率高、不易根治的特点[2]。在中医学上，小儿鼻鼽的主要病因为正气虚弱、外邪入侵，与气候、地域、体质关系密不可分，病位主要在肺脾肾，病机多以本虚标实为主[3]。

虫类药因其具有搜风、通络、活血化瘀之功，成为治疗鼻鼽的常用药[4-5]。现代药理研究发现蝉蜕、地龙、僵蚕等虫类药具有抗过敏的功效，广泛应用于过敏性疾病的治疗中[6-10]。故深入研究含虫类药物组方核心药对治疗过敏性鼻炎的分子机制将更有利于其临床应用。

本研究通过收集治疗儿童AR 的含虫类药物组方，并运用数据挖掘手段以及网络药理学研究的科学方法，发掘虫类药物治疗儿童AR 的物质基础和分子机制，并期望为相应的实验研究和临床应用提供理论基础和研究思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源 以“小儿过敏性鼻炎”“小儿变应性鼻炎”“儿童过敏性鼻炎”“儿童变应性鼻炎”“小儿鼻鼽”为初步搜索词，查找2000—2022 年中国学术期刊全文数据库（CNKI）内的论文，获取与小儿AR 有关的研究论文。以“中医”“中西医结合”“中药”“虫类药物”“治疗”等为检索关键词，进行二次检索，以获取含虫类药物组方防治儿童AR 的有关论文。

1.2 纳入标准 ①中医治疗儿童AR 的医学研究成果及个人的经验总结的论文。②论文中治疗儿童AR的内服药物方剂中含有虫类药。③不限剂型。④对同一人撰写内容基本相同的论文，取其药物组成相对详备的论文。

1.3 排除标准 ①动物实验、理论研究、综述类的论文。②药物组成不明确的论文。③疾病预防用药或误诊用药论文。

1.4 数据的整理与录入 通过初步的文献检索与筛选之后，可获得含虫类药物组方治疗儿童AR 的文献97 篇，共获得含虫类药物组方102 个，其中重复处方13 个，最终纳入处方89 个。录入数据时，涉及到的中药参照《中华人民共和国药典（2020 版）》[11]及全国中医药行业高等教育“十三五”规划教材《中药学》[12]统一规范名称，如：“蝉衣、蝉壳、虫退”统一为“蝉蜕”，“双花”统一为“金银花”，“南豆花”统一为“扁豆花”等，并对药物名称进行规范化处理。

1.5 数据挖掘 运用古今医案云平台网页版，将89个含虫类药物组方数据输入“医案管理”中的“分析池”，组方信息数据由两人共同录入并核对。然后将数据进行用药配伍规律分析，利用药物频数分析、药物关联分析，发现核心药对。

1.6 药对成分收集 将1.5 中发现的核心药对，即辛夷-蝉蜕，作为研究对象，并通过中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）查询辛夷-蝉蜕所有活性成分，并依据药代动力学参数（ADME）：辛夷口服利用度OB≥30%，蝉蜕口服利用度OB≥20%，药物相似性（DL）≥0.18，由此作为化合物分子的筛选条件，筛选出药物中的有效化学成分。

1.7 药对靶点收集 通过药物中有效成分的MOL ID 检索TCMSP 数据库中有效成分对应的药物作用靶点名称。基于药物作用靶点名称通过UniProt 数据库（http：//www.uniprot.org/）查找UniProt KB 中其所对应的UniProt ID 和基因名称，由此构建药物有效成分-靶点基因数据库。

1.8 疾病靶点收集 使用“allergic rhinitis”作为关键词，在GeneCards 数据库（http：//www.genecards.org/）和TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd）检索及筛选靶点基因，找到AR 的疾病潜在靶点基因。

1.9 基因映射 将AR 的疾病潜在靶点基因与核心药对靶点基因，输入Venn Diagrams 系统（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）通过制作疾病药物的韦恩图，可以检测出交集靶点基因，即核心药对与AR 的联合影响的靶点基因，是药对治疗疾病的靶点基因。

1.10 核心药对成分-疾病靶点复合网络的构建 将1.9 中获得的交集靶点基因输入到Cytoscape 3.8.0（www.cytoscape.org）软件，以形成核心药对治疗AR成分-靶点网络图。

1.11 PPI 网络构建及核心靶基因筛选 将交集靶点基因提交至STRING 11.5 数据库（http：//stringdb.org），属性选择为人类，筛选评分≥0.4 构建辛夷-蝉蜕治疗AR 的靶基因蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图。使用Cytoscape 3.8.0 软件对网络进行拓扑结构分析，通过degree 值测试出核心靶基因。

1.12 GO 富集分析与KEGG 信号通路分析 通过Metascape（http：//metascape.org）对1.6 中筛选出的核心靶点进行基因生物过程（GO）富集分析与信号通路（KEGG）富集分析，生物过程（GO）富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及细胞组分（cellular component，CC）3个功能层次。使用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）对结果实现可视化管理。根据P 值筛选出核心药对治疗AR 的靶点的GO、KEGG 过程，进而明确该药对治疗AR 的影响机理。

2 结果

2.1 药物频数分析 纳入统计的97 篇文献中含有89 个处方，共计156 味药物，其中使用频数较高的前16 味药物为辛夷、蝉蜕、防风、甘草、白芷、苍耳子、黄芪、白术、黄芩、乌梅、细辛、僵蚕、地龙、麻黄、五味子、茯苓，频数均在20 次以上，使用率达22.47%以上。见表1。

表1 含虫类药物组方治疗儿童AR 的药物频数统计

2.2 药物关联分析 对使用频次≥20 次的药物进行关联规则分析后，建立支持度≥0.20，置信度≥0.50的药物组合。结合频数统计及关联规则结果分析，可确定辛夷-蝉蜕为含虫类组方治疗儿童AR 的核心药对。见表2。

2.3 辛夷-蝉蜕主要成分及靶点的筛选 通过检索TCMSP 数据库中辛夷-蝉蜕所有活性成分，在设置药代动力学参数后所获得的活性成分分别为辛夷15个、蝉蜕3 个，去除重复值，得到辛夷-蝉蜕药对含有有效成分18 个。基于有效成分的MOL ID 在TCMSP数据库中检索到其对应的药物作用靶点分别为辛夷34 个、蝉蜕27 个，通过去除重复靶点后得到辛夷-蝉蜕药对的作用靶点52 个。

2.4 辛夷-蝉蜕与过敏性鼻炎共有靶点的筛选 将“allergic rhinitis”作为关键词，分别在GeneCards（http：//www.genecards.org）及TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd）检索后获得过敏性鼻炎相关疾病靶点，通过去重后得到1 954 个疾病靶点。将1 954 个疾病靶点与52 个辛夷-蝉蜕药对的作用靶点数据输入jvenn 系统（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）在线制作疾病药物韦恩图，获得辛夷-蝉蜕药对与过敏性鼻炎共有靶点11 个。见图1。

图1 辛夷-蝉蜕药对与过敏性鼻炎共有靶点韦恩图

2.5 辛夷-蝉蜕治疗AR 活性成分-靶点网络图 将辛夷、蝉蜕的18 个共有有效活性成分，以及辛夷、蝉蜕、疾病11 个共有靶点导入Cytoscape 3.8.0，得到辛夷-蝉蜕治疗AR 活性成分-靶点网络图，见图2。结果显示，以化合物MOL000313（Galgravin）及化合物MOL012131（异二氢风藤奎醇A）的靶点最多，各有6个；其次为MOL012123 （脱烷醇内酯A）4 个，MOL000105（原儿茶酸）、MOL012112（去甲槟榔碱）、MOL012125（脱烷醇内酯C）、MOL000314（二苯基四氢呋喃衍生物）各有3 个，可得出这7 个化合物可能是辛夷-蝉蜕治疗AR 的核心成分。且从该图中发现在11 个作用靶点中有6 个靶点与2 种以上活性成分相连。

图2 辛夷-蝉蜕治疗AR 成分-靶点网络图

2.6 PPI 网络与核心靶点分析 通过STRING 数据库，对已获得的共有靶点进行PPI 互作网络图的绘制，结果发现辛夷-蝉蜕治疗AR 的靶点基因有11个。此时，将Degree 值设置为大于6，此时得出的靶点被认为是核心靶点，包括CHRM5、ALOX5、ADRB2、PTGS1、NOS2、PTGS2、CHRM3、CHRM2、KCNH2、ADRA2C 等10 个靶点基因，据此推测这些可能是辛夷-蝉蜕治疗AR 的核心靶点基因。见图3。

图3 辛夷-蝉蜕治疗AR 的靶基因PPI 互作网络图

2.7 生物过程及通路富集结果 将辛夷-蝉蜕药对与AR 共有的10 个核心靶点基因导入metascape 数据库，并对其进行KEGG 富集分析及3 个GO 富集分析。结果显示，辛夷-蝉蜕药对治疗AR 主要通过G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、平滑肌收缩的调节、细胞质核周区、突触后膜、5-羟色胺受体活性、G 蛋白偶联5-羟色胺受体活性、突触后神经递质受体活性、乙酰胆碱受体活性等生物调节过程，见图4。对其进行的KEGG 分析结果显示，辛夷-蝉蜕药对治疗AR主要涉及神经活性配体-受体相互作用信号通路、钙信号通路等信号通路，见图5。

图4 GO 富集分析结果

图5 KEGG 富集分析结果

3 讨论

小儿鼻鼽病因复杂多变，《冯氏锦囊秘录》中总结鼻鼽病因病机为“更有风邪客于皮毛，是以津液不收……名曰鼻鼽”，外因多为风邪为主的外邪侵袭肺卫，其主要内因为“伏风”留于肺脏，外因作用于内因合而发病，以致肺气失宣出现鼻塞、流涕、鼻痒、喷嚏频发、眼痒等症状[13]。关联规则显示辛夷-蝉蜕药对是含虫类药物组方治疗小儿鼻鼽使用支持度最高的药对。陶弘景《本草经集注》有曰：“辛夷味辛，温，无毒，主治五脏身体寒风，风头脑痛”，表明辛夷以其散风寒之功，能够达到宣通鼻窍的之效。黄元御在《玉楸药解》中指出了“蝉蜕发表驱风……轻浮发散，专治皮毛”，且蝉蜕归肺、肝经，具有祛外风、息内风的作用。两药配伍使用具有驱风通窍之效，紧扣“外风、伏风”致本病的病因病机，充分体现了中药处方配伍虫类药物治疗AR 的用药特点。

在儿童AR 发病过程中，由各种炎性细胞和细胞因子等构成其发病机制的生物标记物，而这种生物标记物体现了儿童AR 发生的内在特性。因此，药物成分分子作用机制及其作用靶点的研究可为AR 的精准治疗提供参考和依据。

本研究显示，辛夷-蝉蜕药对治疗AR 的活性成分有化合物MOL000313（Galgravin）、MOL000314（二苯基四氢呋喃衍生物）、MOL012123（脱烷醇内酯A）、MOL012125（脱烷醇内酯C）等木脂素类成分，化合物MOL012131（异二氢风藤奎醇A），MOL000105（原儿茶酸），MOL012112（去甲槟榔碱）等成分。研究发现Galgravin 等木脂素类化合物能有效抑制血小板活化因子（PAF），具有抗炎和镇痛作用[14-16]，而PAF 是促进血小板活化作用最强的与炎症和过敏性反应有关的内源性磷脂介质。

运用Cytoscape 3.8.0 软件筛选出PPI 互作网络中的10 个核心基因，对它们进行KEGG 富集分析及3 个GO 富集分析。其中，GO 生物富集分析结果表明，辛夷-蝉蜕药对主要通过影响下列生物调节过程从而改善AR：G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、血液循环调节的生物过程，细胞质核周区、突触后膜等细胞组分，5-羟色胺受体活性、G 蛋白偶联5-羟色胺受体活性、乙酰胆碱受体活性等分子功能。

在AR 的发病过程中，由副交感神经释放的乙酰胆碱具有刺激腺体分泌黏液，扩张鼻腔血管的作用，导致鼻腔黏液分泌增多，鼻腔变窄通气受限，进而表现为鼻塞、流涕等症，经研究证实调节G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路，能控制乙酰胆碱的释放并获得脱敏的效果[17]，可有效控制AR。鼻黏膜在炎症病理状态下，由于毛细血管内的大量血细胞聚集而导致血流速率降低，从而导致阻力毛细血管收缩或小毛细血管扩张，血管通透性增加，血浆渗出而产生AR 的各种临床表现[18]，而通过调节血液循环可改善鼻黏膜血管通透性，减少血浆渗出，从而达到改善AR 症状的效果。5-羟色胺受体在中枢和外周神经系统参与腺苷酸环化酶信号通路、钾通道等多种信号通路及调节乙酰胆碱等神经递质[19]。5-羟色胺受体活性、G 蛋白偶联5-羟色胺受体活性、乙酰胆碱受体活性的调控，均能通过抑制乙酰胆碱受体（M 受体），参与机体炎症反应、免疫反应，减少鼻腔黏液分泌、缓解鼻塞、降低气道高反应性、抗炎，进而缓解过敏性鼻炎症状[20]。GO富集结果不仅体现了AR 复杂的发病机制，同时还体现中药治疗AR 具有多靶点的特点和生物特性。

KEGG 分析结果显示，辛夷-蝉蜕药对治疗AR主要通过神经活性配体-受体相互作用信号通路、钙离子信号通路等发挥生物学效应。神经活性配体-受体相互作用的信号通路与AR 的发病有密切联系，此通路是质膜上一切与神经细胞内外信号通路有关的受体、配体的集合[21]，它控制并调节胆碱能功能、生理节律、内分泌等生物功能[22]，使AR 的症状得以改善。钙信号通路参与体内钙稳态调节，通过调节以内钙稳态参与体内细胞的增殖、凋亡、转移的过程，且与血管的生成和平滑肌收缩关系密切[23]，研究显示钙离子信号通路与AR 发生的致敏阶段中T 细胞的分化关系密切[24-25]。由此推测，辛夷-蝉蜕药对也能通过调节神经活性配体-受体相互作用信号通路、钙离子信号通路这两条信号通路，在AR 的治疗中发挥抗炎、抗过敏、维持细胞稳态的作用。

4 结论

本研究通过数据挖掘与网络药理学的研究方法，检索到辛夷-蝉蜕药对中18 种活性成分及52 个潜在靶点，药对中过敏性鼻炎有关的靶点有11 个，核心靶点10 个。然后进一步对这些靶点开展了GO 生物过程及KEGG 信号通路富集分析的研究，并由此推测辛夷-蝉蜕药对治疗儿童AR 的物质基础可能与化合物MOL000313（Galgravin）、MOL000314（二苯基四氢呋 喃 衍 生 物）、MOL012123 （脱 烷 醇 内 酯A）、MOL012125（脱烷醇内酯C）等木脂素类成分及化合物MOL012131（异二氢风藤奎醇A）、MOL000105（原儿茶酸）、MOL012112（去甲槟榔碱）等有关。上述的这些活性成分通过调节CHRM5、ALOX5、ADRB2、PTGS1、NOS2、PTGS2、CHRM3、CHRM2、KCNH2、ADRA2C 等靶点，通过调控G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、G 蛋白偶联5-羟色胺受体活性、乙酰胆碱受体活性及5-羟色胺受体活性、钙离子信号通路、调控神经活性配体-受体相互作用等信号通路，从而抑制炎症反应、调节免疫功能，进而达到治疗过敏性鼻炎的目的，其作用特点表现为多成分、多靶点、多通路。本课题为研究辛夷-蝉蜕在治疗儿童AR方面的药理药效机制进行了早期的实验预测，其具体的机理则仍需要通过后续的实验研究证明。