补阳还五汤对Cav-1-/-小鼠脑缺血后m6A修饰和血管新生的影响

徐雅倩 ，陈博威 ，田丰铭 ，刘英飞 ，易健 ，刘柏炎

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；

2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410203；

3.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006

缺血性脑卒中是严重危害人类健康的脑血管疾病之一[1]，血管新生是促进缺血性脑卒中神经功能恢复的重 要 途 径[2]。N6-甲 基 腺 苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰是存在于高级真核生物RNA中的最普遍的修饰之一，RNA的m6A修饰在中枢神经系统生理病理过程中起着重要的生物学作用[3]。补阳还五汤是治疗缺血性中风的有效方剂，但其治疗脑缺血的分子机制仍待进一步阐明。课题组前期研究发现，小窝蛋白1（Cav-1）可能是补阳还五汤治疗脑缺血的潜在靶点[4-6]，但Cav-1对脑缺血后m6A修饰的影响鲜见报道。本研究以Cav-1基因敲除（Cav-1-/-）小鼠为研究对象，观察补阳还五汤对Cav-1-/-小鼠脑缺血后m6A修和血管新生的影响，探讨其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级雄性Cav-1-/-（KO）小鼠与同源野生型（WT）C57BL/6小鼠各36只，6～8周龄，体质量23～28 g。Cav-1-/-小鼠引种自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，由课题组长期饲养在湖南中医药大学第一附属医院SPF级动物房，小鼠子代经PCR鉴定为KO小鼠与同源WT 小鼠后纳入实验。本实验经湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（ZYFY20201215-1）。

1.2 药物

补阳还五汤由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花按120∶6∶4.5∶3∶3∶3∶3比例组成，饮片购于湖南中医药大学第一附属医院。常规浸泡、煎煮后，用旋转蒸发仪浓缩至原药材浓度2 g/mL。浓缩液经课题组前期UPLC-Q-TOF-MS检测，黄芪甲苷Ⅳ、芒柄花素、阿魏酸、芍药内酯苷浓度分别为78.1、46.7、45.6、468.4 μg/mL[7]。

1.3 主要试剂与仪器

m6A 甲基化测定试剂盒（英国Abcam，货号ab185912），兔抗血管性血友病因子（VWF）抗体（英国Abcam，货号ab216566），小鼠抗增殖相关Ki-67抗体（武汉博士德，货号M00254-9），RNA抽提试剂盒（北京碧云天，货号R0026）。智能组织切片成像系统（美国PerkinElmer，型号Vectra3），荧光定量PCR 仪（德国Eppendorf，型号Realplex2）。

2 实验方法

2.1 分组、造模与给药

将KO小鼠和WT小鼠按随机数字表法分别分为对照组、模型组和补阳还五汤组，每组12只。采用大脑中动脉栓塞法复制脑缺血模型。将小鼠麻醉后固定，取颈正中切口，钝性分离左侧颈总、颈内、颈外动脉，将线栓经颈总动脉送入颈内动脉，当线栓上黑色标记点恰好位于颈总动脉分叉时固定线栓，消毒并缝合皮肤。对照组小鼠仅切开皮肤游离血管，随后缝合皮肤。术后2 h参照Longa法[8]对小鼠进行神经行为学评分，评分1～3分为模型复制成功。

根据前期研究[4，6]，确定补阳还五汤给药剂量为18.5 g/kg。补阳还五汤组于成模后给药，模型组及对照组给予等体积蒸馏水，灌胃体积均为0.2 mL/10 g，每日1次，连续7 d。

2.2 神经行为学评分

脑缺血后第7日是血管新生黄金期[2，9]，因此，于第7日进行神经行为学评分。末次给药2 h后，采用Levy A 14分评分法[10]对小鼠神经行为学进行评分。

2.3 取材

神经行为学评分后腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，断头分离全脑，每组随机选取6只进行病理学及免疫荧光检测，剩余6 只进行m6A 水平及RT-qPCR检测。

2.4 m6A水平检测

提取缺血侧皮质总RNA，向各孔中加入200 ng总RNA，并根据m6A甲基化试剂盒说明书分别加入相应试剂，于酶标仪波长450 nm处读取各孔吸光度，比色法检测m6A水平。

2.5 HE染色

脑组织于4%多聚甲醛中固定，常规脱水、透明、包埋及切片，以苏木素-伊红染色，封片后使用智能组织切片成像系统进行全片扫描。

2.6 免疫荧光双标染色

采用免疫荧光双标法检测VWF/Ki-67双标阳性细胞数，VWF标记血管内皮细胞，Ki-67标记增殖细胞，VWF/Ki-67双标阳性细胞表示新生的血管内皮细胞。取全脑组织石蜡切片，依次脱蜡、抗原修复及封闭，分别加入VWF一抗（1∶100）、Ki-67一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜，滴加荧光二抗，避光孵育1 h，PBS冲洗后滴加DAPI染色液，继续孵育10 min，PBS冲洗后甘油封片。使用智能组织切片成像系统进行全片扫描，运用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算单位面积阳性细胞数。

2.7 RT-qPCR检测

取30 mg缺血侧皮质置于1.5 mL离心管中，迅速加入预冷裂解液600 μL，用微型电动匀浆器匀浆，通过离心柱法抽提RNA。将RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，引物序列见表1。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算甲基转移酶样3（METTL3）、甲基转移酶样14（METTL14）、肾母细胞瘤1相关蛋白（WTAP）、肥胖相关蛋白（FTO）及AlkB 同系物5（ALKBH5）mRNA相对表达量。

表1 各基因PCR引物序列

3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8统计软件进行分析。计量资料以±s表示，符合正态分布组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 补阳还五汤对小鼠神经行为学评分的影响

与同基因型对照组比较，WT、KO模型组小鼠神经行为学评分明显升高（P＜0.01）；与同基因型模型组比较，WT、KO补阳还五汤组小鼠神经行为学评分明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与WT模型组比较，KO模型组神经行为学评分明显升高（P＜0.05）；与WT补阳还五汤组比较，KO补阳还五汤组神经行为学评分明显升高（P＜0.01），见图1。

图1 各组小鼠神经行为学评分比较（±s，每组12只）

4.2 补阳还五汤对小鼠缺血侧皮质m6A水平的影响

与同基因型对照组比较，WT、KO模型组小鼠缺血侧皮质m6A水平明显上升（P＜0.01）；与同基因型模型组比较，WT、KO 补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质m6A水平明显下降（P＜0.01）；与WT模型组比较，KO模型组小鼠缺血侧皮质m6A水平明显升高（P＜0.05）；与WT补阳还五汤组比较，KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质m6A水平明显升高（P＜0.01）。见图2。

图2 各组小鼠缺血侧皮质m6A水平比较（±s，每组6只）

4.3 补阳还五汤对小鼠缺血侧皮质病理形态的影响

与同基因型对照组比较，WT、KO模型组小鼠缺血侧皮质神经元排列不规整，细胞间隙增宽，存在空泡，细胞核出现固缩；与同基因型模型组比较，WT、KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质神经元排列相对规整，细胞间隙减小，核仁较清晰；与WT模型组比较，KO模型组小鼠缺血侧皮质神经元出现大量核固缩及空泡；与WT补阳还五汤组比较，KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质神经元排列相对欠规整，存在更多空泡。见图3。

图3 各组小鼠缺血侧皮质形态（HE染色，×400）

4.4 补阳还五汤对小鼠缺血侧皮质血管新生的影响

与同基因型对照组比较，WT、KO模型组小鼠缺血侧皮质VWF/Ki-67 双标阳性细胞数明显增加（P＜0.01）；与同基因型模型组比较，WT、KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质双标阳性细胞数明显增加（P＜0.05）；与WT模型组比较，KO模型组小鼠缺血侧皮质双标阳性细胞数明显减少（P＜0.05）；与WT补阳还五汤组比较，KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质双标阳性细胞数明显减少（P＜0.01）。见图4、图5。

图4 各组小鼠缺血侧皮质VWF/Ki-67双标阳性细胞（免疫荧光染色，×400）

图5 各组小鼠缺血侧皮质VWF/Ki-67双标阳性细胞数比较（±s，每组6只）

4.5 补阳还五汤对小鼠缺血侧皮质m6A 甲基化酶mRNA表达的影响

与同基因型对照组比较，KO模型组小鼠缺血侧皮质WTAP mRNA 表达明显升高（P＜0.01），WT、KO模型组小鼠缺血侧皮质FTO和ALKBH5 mRNA表达明显下降（P＜0.01）；与WT模型组比较，KO模型组小鼠缺血侧皮质WTAP mRNA表达明显升高（P＜0.05），FTO 和ALKBH5 mRNA 表达明显下降（P＜0.01，P＜0.05）；与同基因型模型组比较，KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质WTAP mRNA 表达明显降低（P＜0.01），WT、KO 补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质FTO 和ALKBH5 mRNA 表达明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；与WT补阳还五汤组比较，KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质FTO 和ALKBH5 mRNA 表达明显降低（P＜0.01）。各组METTL3和METTL14 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠缺血侧皮质m6A甲基化酶mRNA表达比较（±s）

表2 各组小鼠缺血侧皮质m6A甲基化酶mRNA表达比较（±s）

ALKBH5 1.01±0.08 0.60±0.10**0.75±0.08#0.99±0.08 0.44±0.11**▲0.60±0.07#◇◇组别WT对照组WT模型组WT补阳还五汤组KO对照组KO模型组KO补阳还五汤组只数6 6 6 6 6 6 METTL3 1.01±0.04 1.08±0.23 0.99±0.24 1.01±0.07 1.05±0.13 0.99±0.15 METTL14 0.99±0.06 1.09±0.20 0.94±0.24 0.97±0.10 1.04±0.10 1.06±0.16 WTAP 0.99±0.11 1.06±0.21 1.01±0.15 1.00±0.07 1.34±0.11**▲1.16±0.07##FTO 1.00±0.10 0.48±0.09**0.70±0.11##0.98±0.08 0.30±0.06**▲▲0.52±0.08##◇◇

5 讨论

缺血性脑卒中属中医学“中风”范畴，多因风、痰、瘀、火留滞经络，气血运行不畅所致，气虚血瘀是中风病重要的病理因素[11]。补阳还五汤为治疗中风病气虚血瘀证的代表方，其君药黄芪有消瘀不伤正之效，臣以当归尾化瘀不伤血，佐以川芎、赤芍、桃仁、红花活血祛瘀，地龙通络。全方具备补气为先，祛瘀为辅，标本兼顾之特点。课题组既往研究表明，补阳还五汤能够通过多途径、多通路、多靶点发挥抗脑缺血损伤的作用[12-13]。

脑缺血后缺血半暗区血流的恢复有赖于侧支循环的建立，新形成的侧支血管可明显改善缺血区周围组织灌流，血管新生通过启动损伤区微血管网重建，为损伤神经元修复、突触重建和神经发生创造良好的微环境[9，14]。临床研究显示，脑梗死患者脑组织血管密度与脑卒中预后呈正相关[2]。本研究中，小鼠在脑缺血后有一定的血管内皮细胞新生，但新生细胞数量有限。补阳还五汤干预能显著提高缺血侧皮质新生血管内皮细胞的数量，提示补阳还五汤能够促进脑缺血后血管新生。

m6A修饰是一种动态的表观遗传修饰，不仅影响mRNA的稳定性，还能影响mRNA的翻译潜能[15]。本研究显示，缺血侧皮质m6A水平较同基因型对照组显著升高，与既往研究结果[16]一致。m6A修饰是动态且可逆的，由甲基化转移酶安装，去甲基化酶删除。为此，本研究检测5种常见的m6A甲基化酶的表达水平，发现KO模型组小鼠缺血皮质区WTAP表达上调，WT及KO模型组小鼠FTO和ALKBH5表达下调，补阳还五汤能逆转上述变化，但METTL3和METTL14甲基化转移酶表达未见明显变化。WTAP是一种m6A甲基化转移酶，其高表达可能导致m6A水平上升[17]，目前其与脑缺血相关的报道较少，有待进一步研究。FTO是一种m6A去甲基化酶，在脑内有丰富的表达[18]。有研究表明，FTO在脑缺血皮质神经元中特异性下调[19]，在梗死心肌细胞中FTO的表达也下调[20]，表明缺血损伤中FTO普遍呈低表达。而过表达FTO可减轻脑缺血导致的神经元凋亡[16]。ALKBH5也是一种m6A去甲基化酶，既往研究表明，在缺氧复氧处理的神经元中敲除ALKBH5会加重神经元损伤[16]。此外，ALKBH5能够去甲基化B 淋巴细胞瘤-2（BCL2），防止BCL2 mRNA降解，并抑制神经元凋亡[21]。推测补阳还五汤可能通过影响m6A修饰，发挥抗脑缺血损伤的作用。

细胞膜小窝是细胞膜上的特殊凹陷，是各类细胞信号分子的聚集地，在血管内皮细胞及神经元中有丰富的表达。Cav-1是小窝中重要的功能结构与核心蛋白，其不仅参与神经系统发育，也能调节血脑屏障通透性、炎症、血管新生和神经再生等参与脑缺血损伤[22]。研究表明，过表达Cav-1可明显促进内皮细胞分化并上调毛细血管样管状结构数量，沉默Cav-1表达则导致毛细血管样管状结构数量减少，提示Cav-1可能在脑缺血后的血管新生过程中发挥重要作用[23]。此外，研究表明，Cav-1可能与m6A水平密切相关，如Cav-1对于FTO敲低细胞的增殖和转移至关重要，FTO能够通过Cav-1影响细胞的能量代谢水平[24]。本研究发现，虽然各组WT小鼠WTAP表达无明显变化，但KO模型组小鼠WTAP表达上调，提示在脑缺血后Cav-1可能通过调控WTAP表达，影响m6A修饰的RNA甲基化水平，其机制有待进一步研究。同时，KO模型组及KO补阳还五汤组与各自WT组相比，FTO和ALKBH5表达下降，提示在脑缺血后Cav-1可能通过影响去甲基化酶FTO及ALKBH5，调控m6A水平。此外，本研究还发现补阳还五汤能够促进脑缺血后神经功能恢复及血管新生，降低病理形态损伤及m6A修饰的RNA甲基化水平，但KO小鼠的神经功能恢复、病理形态改善、新生血管内皮数目及RNA甲基化水平不及WT组。

综上所述，Cav-1缺失会抑制脑缺血后血管新生，加剧m6A水平失调。补阳还五汤可能通过Cav-1调控脑缺血小鼠m6A修饰的RNA甲基化水平，促进血管新生。本研究同时从Cav-1及m6A修饰角度探讨补阳还五汤促进脑缺血后血管新生的机制，可为补阳还五汤的表观转录机制研究提供新思路。