复发性流产妇女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T多态性研究

郭跃丽，汤丽云，郑温洁莹，陈孟权，孔万仲，王明山

复发性流产的病因十分复杂，受遗传、内分泌、免疫、感染及子宫解剖结构等多种因素影响[1-2]。近年来研究发现，孕妇血栓前状态也是导致复发性流产的重要影响因素[3-4]。血栓前状态又称为易栓症，是一种血液高凝状态，引起全身弥漫性血栓形成，并进一步造成孕妇子宫胎盘或脐带血栓形成、梗死，引发流产[5-6]。对于复发性流产妇女，临床推荐进行血栓性基因突变筛查，以明确病因，并进行针对性治疗。目前研究发现，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性与血浆中凝血因子Ⅻ活性改变密切相关[7-8]，但具体的机制尚不明确。本研究分析复发性流产妇女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性特点，为复发性流产的临床基因诊断提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性收集2022 年1—6 月温州市中医院收治的138 例复发性流产患者（观察组）。纳入标准：（1）符合复发性流产的诊断标准[9]；（2）连续3 次及以上妊娠28 周前发生自然流产；（3）进行凝血因子Ⅻ基因Exon1 测序；（4）病例资料完整。排除标准：（1）生殖道病原体感染；（2）子宫结构异常，如先天性子宫畸形、子宫颈机能不全、宫腔粘连及子宫肌瘤等；（3）内分泌疾病，如多囊卵巢综合征、甲状腺功能疾病及黄体功能不全等；（4）夫妻任何一方染色体异常；（5）自身免疫抗体检查异常。同期选取69 例妊娠史良好的健康女性（对照组），纳入标准：至少有1 次成功分娩，无流产史、早产史、产后出血史及妊娠合并症史。

观察组年龄25 ～41 岁，平均（31.3±3.5）岁；孕前 体 质 量 指 数 19.35 ～ 32.86 kg/m2，平 均（26.10±2.04）kg/m2；文化程度：初中24例，高中49例，大专及以上65 例。对照组年龄23 ～38 岁，平均（30.5±3.2）岁；孕前体质量指数18.96 ～31.05 kg/m2，平均（25.45±1.88）kg/m2；文化程度：初中10 例，高中24 例，大专及以上35 例。两组一般资料差异无统计学意义（P ＞0.05）。本研究经温州市中医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法 所有受检者均采集空腹静脉血，一支采血管为乙二胺四乙酸抗凝，用于提取单个核细胞D NA 分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性；另一支采血管为0.109 mol/L 枸橼酸钠抗凝，用于分离血浆检测凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）及D-二聚体。

1.2.1 凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性分析 使用苯酚-氯仿法提取血液中的单个核细胞DNA，干燥DNA 沉淀物置于-20 ℃保存待检。采用实时荧光定量PCR 扩增技术分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T，PCR 引物使用Primer Premier 5 软件 设 计，上 游引 物：5’-CCA GTCCCACTATCTAGAAAAG-3’，下 游 引 物：5’-CTATCAC AGCCATGAGCCAT-3’，产物长度594bp。反应条件：95℃预变性5 min，95 ℃变性40 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸10 min，总循环30 个，4 ℃冷却结束。检测仪器为伯乐CFX Connect Real-Time 实时定量PCR 仪（美国BioRad 公司）。使用Chromas 软件将测序结果与GenBank 基因库中公布的凝血因子Ⅻ基因序列比对，分析基因型和等位基因型。

1.2.2 凝血指标 采用法国Stago STA-R 全自动血凝仪（配套试剂由法国STAGO 公司提供）及凝固法检测PT、APTT 和FIB，采用SEKISUI CP-3000 全自动血凝仪（配套试剂由SEKISUI 公司提供）及免疫比浊法检测D-二聚体。

1.3 统计方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，采用Hardy-Weinberg 遗传平衡对样本的群体代表性进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t 检验；多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD 检验；计数资料采用2检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 分布特点两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（均P ＞0.05），具有群体代表性。在基因型分布上，两组CC、CT、TT 基因型频率差异有统计学意义（2=7.888，P ＜0.05），观察组CT基因型频率高于对照组（2=4.696，P ＜0.05），TT 基因型频率低于对照组（2=7.749，P＜0.05），而两组CT 基因型频率差异无统计学意义（2=1.660，P ＞0.05），见表1。在等位基因分布上，观察组的C 等位基因频率高于对照组（P ＜0.05），T 等位基因频率低于对照组（P ＜0.05），见表2。

表1 两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 基因型分布 例（%）

表2 两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 等位基因分布 例（%）

2.2 两组不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比较两组凝血因子Ⅻ活性差异无统计学意义（P ＞0.05），且两组CC、CT、TT 基因型的凝血因子Ⅻ活性差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。同组内3 种基因型的凝血因子Ⅻ活性比较，CC 基因型凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型，且CT基因型凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型（均P ＜0.05），见表3。

表3 两组不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比较 %

2.3 观察组不同基因型患者的凝血指标及凝血因子Ⅻ活性比较 观察组CC 基因型患者的APTT水平低于CT 和TT 基因型患者，且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者（均P ＜0.05）。观察组CC、CT、TT 基因型的PT、FIB、D-二聚体水平差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表4。

表4 观察组不同基因型患者的凝血指标及凝血因子Ⅻ活性比较

3 讨论

复发性流产一直是妇产科研究的重点，近年来研究发现，复发性流产孕妇具有血栓形成倾向，纤溶功能降低而凝血功能增强，血液呈高凝状态[10-11]。凝血因子Ⅻ是一种由肝脏合成的丝氨酸蛋白酶，具有促进纤溶、抗血栓的作用[12-13]。目前分子基因学研究发现，不明复发性流产可能与凝血因子Ⅻ基因启动子区DNA 甲基化水平升高相关[14]。也有研究表示，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 表达与凝血因子Ⅻ基因的翻译效率密切相关，进而影响凝血因子Ⅻ在血浆中的表达水平和活性状态[15]。

本研究分析复发性流产妇女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性特点，结果显示观察组的CT基因型频率高于对照组，观察组的TT 基因型频率低于对照组；且观察组的C 等位基因频率高于对照组，T 等位基因频率低于对照组（均P ＜0.05）。上述结果说明凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 为CT 基因型可能与复发性流产有关。国外有关凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性的研究也证实CT 基因型可能是孕龄期妇女发生复发性流产的重要发病原因[16]。本研究进一步研究发现两组人群的凝血因子Ⅻ活性并无明显差异，但深入对比不同基因型的凝血因子Ⅻ活性，可以发现CC 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型，并且CT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型，TT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性最低。这可能是因为凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 的T 等位基因发生突变，可使原始的起始密码子死亡碱基重新配对，形成新的起始密码子，并使下游的终止密码子也发生改变，使得凝血因子Ⅻ基因翻译提前结束，故携带C 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明显上升，而T 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明显下降。另外，本研究比较不同基因型的复发性流产妇女的血浆凝血指标发现，CC 基因型患者的APTT 水平低于CT和TT 基因型患者，且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者，即CC 基因型患者的APTT水平最低，而TT 基因型患者的APTT 水平最高。这说明复发性流产妇女凝血因子Ⅻ活性越高与APTT 缩短存在关联。目前已有研究证实APTT与复发性流产密切相关，APTT 反映内源性途径凝血因子的缺陷，APTT 缩短，血液处于高凝状态，提示凝血亢进，会使子宫局部组织形成微血栓，造成胚胎缺血、缺氧，进而导致流产。胚胎死亡后发生自溶，激活内源性凝血途径，进而影响凝血功能。另外，妊娠期孕妇本身会出现生理性的血液高凝状态，加上凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 遗传病变，APTT 缩短，凝血因子Ⅻ活性增高，易发生血栓形成，梗塞子宫-胎盘，影响血流循环，胎儿在子宫内缺血缺氧，未得到及时供氧，造成胎儿死亡，引起流产[17]。本研究发现其他的凝血指标如PT、FIB、D-二聚体水平，不同基因型患者无明显差异，这可能是因为APTT是反映内源性凝血途径的指标，临床常用于测定内源性途径的凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ等[18]。

综上所述，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 为CT 基因型可能与复发性流产有关，T 等位基因突变为C，引起凝血因子Ⅻ活性增高，APTT 缩短，导致血液高凝状态和血栓形成，梗塞子宫-胎盘，诱发流产。对于复发性流产妇女，临床可检测凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性，进行基因诊断，明确病因，为妊娠保胎治疗提供参考。