微小RNA-18a 联合胃泌素17 在早期胃癌中的诊断价值

梁 雄，赵贵君，汪 锋，朱 虹，王清华

（内蒙古自治区人民医院内镜中心，内蒙古 呼和浩特 010017）

胃癌是常见的恶性肿瘤，病死率在恶性肿瘤中位居第二，我国胃癌新发病例和死亡病例约占全球的42.6%和45.0%[1]。胃癌的预后与肿瘤的分期密切相关，早期胃癌患者5年生存率超过90%[2]。常规内镜观察加组织活检为金标准，但由于侵入性操作等原因，无法作为常规筛查手段。胃泌素作为重要的胃癌血清学筛查手段，操作简单、成本低，但在临床中单独应用具有一定的局限性[3]。微小RNA（microRNA）作为内源性非编码微小RNA 近年来被发现与胃癌的发生发展密切相关[4]。有研究表明早期胃癌中已有部分microRNA 特异性表达，且有研究表明[5]microRNA在血液中阳性检出率要高于胃癌相关标记物CEA 等。这进一步表明microRNA 在早期诊断胃癌中有很大的潜力。本研究通过检测早期胃癌外周血中的G-17 和microRNA-18a 水平变化，以明确其在早期胃癌中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年1 月至2020 年9 月在我院就诊的320例患者，按照内镜活检和病理结果，纳入慢性非萎缩性胃炎组98 例、慢性萎缩性胃炎组84 例、早期胃癌组76例（癌细胞局限于黏膜和黏膜下层）、进展期胃癌组62 例（癌细胞侵及肌层、浆膜层或浆膜外）。其中，早期胃癌组男性39 例、女性37 例，平均年龄（56.29±8.25）岁；进展期胃癌组男性37 例、女性25 例，平均年龄（59.22±8.86）岁；慢性非萎缩性胃炎组男性58 例、女性40 例，平均年龄（45.68±8.13）岁；慢性萎缩性胃炎组男性47 例、女性37 例。4组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有病例排除消化道出血及消化性溃疡等；在采集血液标本前均未经手术、放疗以及化疗；无特殊用药史及无心、肝、肾等疾病；在采集样本前均获得患者或家属的知情同意，并通过内蒙古自治区人民医院伦理委员会审批。

2 方法

2.1 血microRNA-18a的测定

采集清晨空腹外周血5 mL，凝固后以3000 r/min离心15 min，分离血浆，置于-80 ℃冰箱中保存备用。按照试剂盒（TR-IZOL Reagent，美国Invitrogen公司）的说明书提取血浆总RNA，测定RNA提取液的总RNA 浓度并利用紫外分光光度计NanoDrop ND-1000 测定纯度。利用1%变性琼脂糖凝胶电泳对总RNA 质量进行分析。应用荧光定量PCR 仪检测血浆microRNA-18a 的表达，选取U6 作为内参基因，microRNA-18a 和U6 的上游引物序列根据NCBI 上发表的基因序列使用Primer 5.0设计，microRNA-18a上游引物序列为：5′-GTGCTAAGGTGGATCTAGCAG-3′，U6 上游引物序列为：ACGATACAGAGAAGATTAGCATGG；下游引物为反转录试剂盒中的通用引物，引物序列为：GATCGCCCTTCTACGTCGTAT。所使用的试剂盒为TaKaRa 公司生产的TB Green®Premix Ex Taq™（Tli RNaseH Plus）（具体反应体系见表1），反应条件为95 ℃30 sec、95 ℃5 sec、60 ℃30 sec，循环40 次，荧光信号在60 ℃时检测。相对miRNA的表达水平用2－△△Ct表示。

表1 实时定量PCR反应体系

2.2 胃泌素-17测定

采用芬兰Biohit 公司ELISA 试剂盒，采集清晨空腹外周血5 mL，凝固后以3000 r/min 离心15 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱中保存备用。使用酶联免疫吸附实验法检测患者G-17。

3 统计学方法

所有数据采用SPSS 21.0统计学软件进行分析，年龄、血清G-17 水平等计量资料以（±s）表示，采用t检验或F检验，应用受试者工作特征曲线下面积（ROC）评估诊断的敏感度和特异度。检验水准为α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 血浆microRNA-18a和G-17的表达情况

早期胃癌组G-17 水平低于进展期胃癌组、慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组，差异有统计学意义（P＜0.05）。早期胃癌组血浆microRNA-18a水平高于慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组，但低于进展期胃癌组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 4组G-17及microRNA-18a检测结果比较（±s）

表2 4组G-17及microRNA-18a检测结果比较（±s）

注：与慢性非萎缩性胃炎组比较，aP ＜0.05；与慢性萎缩性胃炎组比较bP ＜0.05；与早期胃癌组比较cP ＜0.05。

组别例数G-17(pmol/L)miRNA-18a慢性非萎缩性胃炎组慢性萎缩性胃炎组早期胃癌组进展期胃癌组98 84 76 62 F P 8.53±8.78 7.33±7.54 3.14±1.92ab 14.92±7.05abc 20.178＜0.001 1.01±0.14 1.56±0.33a 2.55±0.49ab 3.13±0.54abc 873.263＜0.001

4.2 血浆microRNA-18a联合G17对早期胃癌的诊断价值

血浆microRNA-18a 水平对EGC 的诊断价值根据ROC 分析，最佳的microRNA-18a 相对表达量的临界值为2.55，诊断敏感度76.7% ，特异度83.2%。G-17 水平对EGC 的诊断价值根据ROC 分析，最佳的G-17 相对表达量的临界值为3.14，诊断敏感度71.7%，特异度75.8%。G-17联合microRNA-18a水平对EGC 的诊断价值根据ROC 分析，诊断敏感度81.5%，特异度88.9%（见图1）。

图1 早期胃癌患者miR-18a和G17表达的ROC曲线

5 讨论

胃癌（GC）是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率及病死率均排在前列[1]。由于胃癌早期特异性症状不显著，又缺乏有效的筛查和早诊手段，很多患者在确诊时已属中晚期，错过治疗最佳时期，患者5年的生存率不足30%[6]。晚期胃癌患者生活质量差，给家庭及社会带来沉重的负担。而如果能够及时发现，大部分早期胃癌（early gastric cancer，EGC）乃至癌前病变在内镜下即可获得根治性治疗，大大节约了医疗资源和社会成本，对改善患者愈后具有重要意义[2]。因此，寻找一种简单、可靠、敏感度及特异度较高的诊断方法成为临床上亟需解决的问题。

目前临床上确诊胃癌的金标准为胃镜活检。由于其操作给患者带来痛苦等原因，该方法不适合作为筛选普查的手段。血清肿瘤标志物的检测已作为胃癌筛查的有效手段，然而，这些标记物如CEA、CA724 等缺乏足够的敏感性和特异性以促进早期检测[7]。

胃泌素17是一种多肽类激素，由胃窦G细胞合成和分泌，用来调节胃酸的分泌和胃黏膜生长功能，是近年来早期胃癌筛查的新手段[8]。当胃窦出现萎缩时，胃泌素17 分泌水平会出现下降[9]。本研究对慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、早期胃癌和胃癌血中的G-17 水平进行了比较。结果显示，早期胃癌组G-17 水平低于进展期胃癌组、慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组。其原因是早期胃癌在发生发展上伴随着G-17 分泌减少和消耗；而进展期胃癌组G-17 水平显著高于慢性非萎缩性胃炎组和慢性萎缩性胃炎组。其原因可能是胃泌素促进肿瘤生长，在一定程度上表现出高胃泌素血症[10]。通过本研究的ROC曲线可以发现，G-17诊断早期胃癌敏感度高达71.7%，但是特异度仅是75.8%，考虑其分泌到血循环中受到一些因素的影响，比如饮食结构、胃酸、药物、感染等，本研究在试验前要求患者清淡饮食，戒烟，停用抑制胃酸药物及抗生素1周以上，并采集空腹血等，从而确保G-17在血液中的分泌水平，故从本研究中可以看出单独应用G-17作为手段筛查早期胃癌不够理想。

microRNA 是一组非编码小分子RNA，它们通过抑制mRNA 的稳定性和翻译而参与基因表达的翻译后调控。最近的研究已经表明，特定microRNA的异常表达参与了各种人类恶性肿瘤，还有一些的microRNA已被证明具有重要作用，包括致癌和肿瘤抑制功能[11]。研究显示[12]microRNA-18a是一种致癌基因，通过负调节PIAS3从而调节STAT3靶基因，在胃癌发展中起着至关重要的作用。此外，研究表明[13]microRNA在血清和血浆中也有稳定的表达，在常温、强酸强碱环境以及反复冰冻及融解样本，其稳定性不受影响；血浆中microRNA 耐核糖核酸酶非常稳定，并且血浆和血清中的样本检测有很好的相关性，这些特点都很适合作为肿瘤诊断的生物学标记物。有研究提示[14]，与正常组织相比，胃癌组织中MiR-17-92 簇过度表达，能够促进肿瘤的发生，microRNA-18a是MiR-17-92簇编码7个microRNA中表达最高且最频繁的microRNA。本研究通过PCR荧光定量方法检测慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、早期胃癌和进展期胃癌患者血浆中的microRNA-18a表达水平。结果提示早期胃癌组和进展期胃癌组血浆microRNA-18a 表达水平显著上调，且高于慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组。这提示血浆microRNA-18a 可能是胃癌的一个重要分子标志物，对早期胃癌的诊断有一定指示作用。本研究ROC曲线结果分析提示，早期胃癌中microRNA-18a具有较好的敏感度及特异度，分别为76.7% ，83.2%。进一步联合G-17 监测，诊断早期胃癌的敏感度和特异度分别为81.5%、88.9%。这也进一步说明二者联合后对早期胃癌的诊断有一定的指示作用，且两者联合可大大提高诊断的敏感度和特异度。

本研究的不足在于样本量较少，对于胃泌素17及microRNA-18a的最佳临界值确定，临床上仍需要大量样本的研究来共同探讨。血浆microRNA-18a浓度与外周血细胞的相关性仍有待进一步大样本研究确定。

综上所述，胃泌素17、microRNA-18a 对早期胃癌的诊断具有一定的临床价值。二者联合诊断早期胃癌的敏感度和特异度较高，并且为非侵入性，能够为早期胃癌的诊断提供可靠参考，值得进一步推广应用。