气相色谱法测定蒙药肉豆蔻五味中4 种药效物质的含量

安佳斯，闫婷婷，贾 鑫，朱小玲，刘天龙，董 玉*

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010059；2.内蒙古自治区蒙药药效物质与质量控制工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010110；3.内蒙古自治区药品检查中心，内蒙古 呼和浩特 010010；4.内蒙古医科大学附属医院药剂部，内蒙古 呼和浩特 010050；5.内蒙古自治区国际蒙医医院药学部，内蒙古 呼和浩特 010065）

肉豆蔻五味是蒙医临床治疗心脏病的经典方剂。该方源于《蒙医药方汇编》，现收录于《中华人民共和国卫生部药品标准：蒙药》[1，2]。该方由肉豆蔻、木香、土木香、广枣和荜茇五味药材组成，用于治疗心烦失眠、心神不安、心脑供血不足、缺血性心脏病等[2]。

肉豆蔻属心脏良药，又称“匝迪”。其具有抗心律失常、促红细胞生成、促进缺血再灌注损伤心肌的恢复、保护心脏的作用[2，3]，主要成分包括挥发油和脂肪油等[2]。木香用于胸脘胀痛、泻痢后重、食积不消、不思饮食等，主要成分包括萜、内酯类等[3]。土木香又称“玛奴”，主治感冒头痛、恶寒等。对心肌细胞缺氧损伤有保护作用，主要成分包括菊糖、萜、内酯类等[4]。广枣具有抗心律失常、抗氧化等药理作用，主要成分包括有机酸类和黄酮类等[5，6]。荜茇又称“必必灵”，其主要成分挥发油可调理胃火、滋补强壮、平喘、祛痰、止痛等[7]。

课题组前期建立了高效液相色谱测定Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯、土木香内酯等内酯类成分的方法[8，9]。蒙药肉豆蔻五味中含有挥发性成分，课题组前期未建立对肉豆蔻五味的气相色谱检测方法以及相关质量标准，而气相色谱法操作简便、灵敏度高、选择性强。因此，本文通过建立气相色谱法测定肉豆蔻五味中4种药效物质的含量，旨在完善蒙药肉豆蔻五味的质量评价体系，为肉豆蔻五味的进一步研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

气相色谱仪（美国Agilent 7890B，安捷伦化学工作站）；DZKW-D-2电热恒温不锈钢水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品与试剂

蒙药肉豆蔻五味各味药材：肉豆蔻（批号：18112702）、木香（批号：18090403）、土木香（批号：170801）、广枣（批号：190112）、荜茇（批号：180901）。以上药材购于内蒙古天力药业有限公司。甲基丁香酚对照品（中国食品药品检定研究院，111642-200301）；土木香内酯（99.4%）（中国食品药品检定研究院，110760-201811）、异土木香内酯（98.8%）（中国食品药品检定研究院，110761-201806）；去氢木香内酯（99.8%）（上海麦克林生化科技有限公司，C11222536）；乙醇（95%）（天津市津东天正精细化学试剂厂，20190901）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：HP-5 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，1 μm）；高纯氮气（20 mL/min）；助燃气为空气（40 mL/min）；氢火焰离子化检测器温度280 ℃，进样口温度230 ℃，分流比9∶1，进样量1 μL；柱温箱梯度升温，升温条件见表1。

表1 柱温箱程序升温条件

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制精密称定甲基丁香酚对照品、土木香内酯对照品、异土木香内酯对照品、去氢木香内酯对照品，用甲醇配制成质量浓度分别为0.21 mg/mL、0.606 mg/mL、0.72 mg/mL、0.435 mg/mL的对照品溶液。分析结果见图1。

图1 对照品溶液气相色谱图（A:甲基丁香酚；B:土木香内酯；C:异土木香内酯；D:去氢木香内酯）

2.2.2 供试品溶液的制备 按照比例称取肉豆蔻五味10 g，置500 mL 圆底烧瓶中，10 倍量95%乙醇回流提取每次2 h，合并滤液，回收溶剂，定容至5 mL容量瓶。微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进行分析。结果见图2。

图2 供试品溶液气相色谱图（峰1：甲基丁香酚；峰2：土木香内酯；峰3：异土木香内酯；峰4：去氢木香内酯）

2.3 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下的对照品溶液1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL，按照“2.1”项下色谱条件进行分析。以X-Y绘制标准曲线，纵坐标为色谱峰面积（Y），横坐标为进样量（X）（μg），计算各个化合物的相关系数（r）、回归方程和线性范围。结果见表2。

表2 蒙药肉豆蔻五味中4种化学成分的保留时间、回归方程、相关系数和线性范围

2.4 精密度试验

按照“2.2.2”项下制备方法，制备供试品溶液，采用1 份溶液连续进样6 次的方法测定精密度。测得甲基丁香酚、土木香内酯、异土木香内酯、去氢木香内酯峰面积的RSD%（n=6）分别为2.22%、1.93%、1.72%、2.70%。结果表明该方法精密度良好。

2.5 重复性试验

按照“2.2.2”项下制备方法，同时制备供试品溶液6份，按照“2.1”项下色谱条件，将6份制备的供试品溶液注入气相色谱中分析。结果甲基丁香酚、土木香内酯、异土木香内酯、去氢木香内酯的平均含量分别为0.0263%、0.158%、0.163%、0.058%；RSD%（n=6）分别为1.97%、2.42%、2.81%、2.63%。结果表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

按照“2.2.2”项下制备方法，制备供试品溶液1份，按照“2.1”项下色谱条件分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h检测，测得甲基丁香酚、土木香内酯、异土木香内酯、去氢木香内酯峰面积的RSD%（n=6）分别为2.85%、1.90%、2.12%、1.43%。实验结果表明供试品溶液于24 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称定6 份肉豆蔻五味药材各5 g，分别加入甲基丁香酚1.350 mg、土木香内酯8.020 mg、异土木香内酯8.200 mg、去氢木香内酯3.010 mg，共同定容于5 mL 容量瓶中，得供试品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率及其RSD 值。实验结果见表3。

表3 加样回收率试验结果[n（%）]

2.8 样品含量测定

取12批不同批次的蒙药肉豆蔻五味药材，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，取供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，记录峰面积，按标准曲线法计算各个批次药材中4 种成分的含量（见表4）。

表4 12批次样品的4个成分含量测定结果[n（%），n=3]

3 讨论

与前期实验室制定的高效液相色谱测定Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯、土木香内酯等内酯类成分的方法相比，本文采用的气相色谱法测定土木香内酯、异木香内酯、去氢木香内酯等成分可免去样品前处理的过程，省时省力；同时采用高纯氮气作为载气，经济便捷。且气相色谱法具有样品用量少、高分离效能、高度选择性、高度灵敏性、分析速度快、操作简便等优点，适合肉豆蔻五味中挥发性成分的测定。

课题组优化多种实验方式，以期完善测定方法。当测定时间超过120 min 后，再无其他色谱峰出现。因此，确定测定总时间为120 min。当柱温箱采用等度升温时，色谱峰分离度较差；采用梯度程序升温法时，可选出化合物最佳出峰温度。当进样口温度为180 ℃时，所得色谱峰易出现肩峰，分析原因为复杂基质会对待测成分的峰形产生影响；进样口温度升至230 ℃时，上述情况消失，因此确定进样口温度为230 ℃。当分流比为9∶1 时，可在保证待测成分被准确检测的同时，排除大多数基质成分对仪器本身及色谱柱的影响。

课题组测定了12 批次肉豆蔻五味药材中甲基丁香酚、土木香内酯、异土木香内酯、去氢木香内酯的含量，含量相对稳定，且4 种成分峰型尖锐、对称性高，与其他峰的分离度较好，可以作为肉豆蔻五味的质量控制方法之一。

肉豆蔻五味中肉豆蔻为君药，研究表明肉豆蔻可消减动脉粥样硬化斑块，使全血黏度含量减少[10]。同时诸多研究表明甲基丁香酚、土木香内酯、异土木香内酯、去氢木香内酯可在抗炎、抗肿瘤、抗心律失常等多个方面发挥药理作用。其中甲基丁香酚是肉豆蔻的主要成分，具有抗菌、镇痛抗炎、抗氧化损伤等药理活性。王宏伟等[11]的网络药理学研究中，活性化合物中甲基丁香酚的OB 值大，活性成分-靶点预测图中甲基丁香酚的度值排名较前，对缺血性心脏病有一定的作用。实验证明甲基丁香酚可以增强细胞活性，保护器官组织，为研究急性器官缺血提供了参考价值[12]。土木香内酯和异土木香内酯是从土木香的根中分离出的半萜内酯类化合物，具有较好的抗炎、驱虫、抗菌、抗肿瘤等作用[13～17]。土木香内酯通过诱导活性氧（ROS）的产生和DNA损伤的方式达到抗肿瘤作用，还可以选择性地抑制信号转导及转录激活因子3（STAT3）的活性，发挥抗肿瘤活性。王紫洁等[18]研究得出土木香内酯通过阻断Wnt/β-catenin 信号通路对食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭产生抑制作用的同时促进其凋亡，为治疗食管癌提供新思路。异土木香内酯的抗肿瘤作用近些年备受关注。相关研究显示其具有良好的抗肿瘤效果[19]。胡艳玲等[20]通过体外培养宫颈癌细胞株，研究得出异土木香内酯可有效抑制宫颈癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化。张秀娟等[21]选取MCF-7细胞株，通过MTT 法与SRB法研究得出，异土木香内酯对MCF-7 细胞具有较强增殖抑制活性，可以通过PI3K/Akt 途径和线粒体途径共同诱导MCF-7 细胞凋亡，从而抑制乳腺癌的发生。去氢木香内酯是木香的主要活性成分，其具有抗肿瘤、抗菌、抗溃疡等作用[22]。研究表明，去氢木香内酯可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增生，还可以抑制ADP诱导的血小板聚集，达到抗心血管病的药效作用[23，24]。

综上所述，甲基丁香酚、土木香内酯、异木香内酯、去氢木香内酯可作为蒙药肉豆蔻五味的药效成分。本研究有利于进一步研究肉豆蔻五味的药效关系，为肉豆蔻五味的质量控制提供理论依据。