肾交感神经消融对慢性心力衰竭大鼠线粒体功能的影响

罗仪山 郭志琴 刘 真 李韶南 陈平安

1.广州市第一人民医院急诊科，广东广州 510180；2.广州市第一人民医院心内科，广东广州 510180；3.广州市番禺区中心医院心内科，广东广州 511400

心力衰竭（简称“心衰”）是一种发病率和病死率很高的临床综合征，交感神经系统（sympathetic nervous system，SNS）及肾素- 血管紧张素- 醛固 酮 系 统（renin-angiotensin-aldosterone System，RAAS）的过度激活在其发生发展中起重要作用。虽然β 受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）和 血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin Ⅱ type1receptor blocker，ARB）等药物能抑制SNS、RAAS 改善心衰预后，心衰患者的五年生存率也只有50%。因此，探寻一些新的心衰的治疗方法一直是学者们研究的热点。

肾交感神经消融（renal denervation，RDN）通过消融肾动脉外膜的交感神经，进而降低全身交感神经活性，起到改善心功能的作用[1]。本课题组的前期研究也显示，它是一种安全有效的治疗心衰方法[2]。但有研究显示RDN 后肾交感神经会再生，从而影响RDN 的疗效[3]，具体机制尚不明确。线粒体是心肌细胞的“动力源”，心衰与线粒体功能障碍密切相关[4]，而交感神经活性与线粒体功能有关[5]，推测RDN 可以通过改善心衰大鼠心肌细胞线粒体功能从而对心衰有益。本研究通过检测心肌细胞三磷酸腺苷（adenosine triphophate， ATP）浓度以及线粒体外膜转运酶Tom-20 表达量来探究RDN 及抑制RDN 后肾交感神经再生对慢性心衰大鼠心肌细胞线粒体功能的影响。

1 资料与方法

1.1 心衰大鼠模型的制备

选取7 周龄健康SD 大鼠，雌雄不限（雄性160 ～220 g，雌 性100 ～150 g，广 东 省 医 学 实验动物中心提供），用腹主动脉缩窄法（transverse aortic constriction，TAC）制备大鼠慢性心衰模型[6]。大鼠术前禁食24 h，饮水不限，10% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉成功后将其仰卧位固定于手术台，腹部备皮，常规消毒铺巾后沿腹中线开腹，游离出部分腹主动脉后使用4-0 缝线将6#针头（外径约0.64 mm）与腹主动脉一起在肾动脉上方结扎，迅速拔出针头。将肠管恢复原位，腹腔给0.5 ml 头孢唑肟（辽宁美亚制药有限公司，国药准字H20090513，规格：10 mg/ml），逐层缝合腹壁肌肉及皮肤。大鼠苏醒后放回笼中，自由饮食。实验操作遵守广州市第一人民医院医学伦理委员会规定（伦理号：2017-203）。

1.2 RDN方法

对TAC 术后18 周大鼠行RDN，术前禁食24 h，饮水不限，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉成功后将其仰卧位固定于手术台，腹部备皮，常规消毒铺巾后沿腹中线开腹，轻柔拨开肠管，分离出左侧肾动脉，并用2-0 缝线于其下穿过，用湿润的棉球保护周围组织，防止损伤。将溶于无水乙醇的10%苯酚溶液顺着缝线滴落，作用于左肾动脉周围，消融10 min[7]。对右侧肾动脉进行同样的处理。两侧肾动脉交感神经消融完成后恢复肠管，腹腔给予0.5 ml 头孢唑肟，逐层缝合腹壁肌肉层及皮肤。大鼠苏醒后放回笼中，自由饮食。

1.3 实验动物分组

随机选取TAC 后大鼠为心衰组（n=3，暴露双侧肾动脉但不消融肾交感神经），RDN 后大鼠又根据腹腔注射药物的不同分为RDN 组（n=3，RDN 术后8 周腹腔注射生理盐水），Nogo-B 组（n=4，RDN术后8 周腹腔注射神经再生抑制剂Nogo-B[8]），NEP 组（n=3，RDN 术后8 周腹腔注射Nogo-B 拮抗剂NEP-40）。Nogo-B 组大鼠每天腹腔注射给药0.02 mg Nogo-B（Alpha Diagnostic Intl Inc.，美国），持续2 周，NEP 组大鼠每天腹腔注射给药0.025 mg NEP-40（ApexBio，美国，货号：B5247），持续2 周。RDN 组每天给相应体积生理盐水，持续2 周。

1.4 组织取材

TAC 术后44 周（即给药完成后16 周）处死大鼠，收集心脏及肾动脉标本并用4℃ PBS 液清洗。将心脏标本装于冻存管，于液氮中迅速冷冻，随后保存于-80℃冰箱。将肾动脉置于4%多聚甲醛中固定然后石蜡包埋。

1.5 HE染色

将包埋有肾动脉的蜡块切成厚度5 μm 切片，脱蜡水化后行HE 染色，脱水透明后用中性树脂封片。光学显微镜观察肾动脉神经变化，通过比较肾动脉外膜神经纤维数目评估RDN 术，神经再生抑制剂Nogo-B 及其拮抗剂NEP-40 对肾动脉周围神经的影响。

1.6 ATP的测定

心肌细胞ATP 浓度根据增强型ATP 检测试剂盒S0027（碧云天，中国上海）操作说明书用ELISA法测得。用ATP 裂解缓冲液裂解大鼠心肌细胞，4℃下12 000 g 离心5 min，取上清液测定ATP 浓度，根据ATP 标准曲线计算其浓度。

1.7 Western blot

从超低温冰箱中取出大鼠心肌组织约100 mg，快速剪碎后加入1 ml 裂解液，充分研磨，然后将组织匀浆以12 000 g 在4℃低温离心机中离心10 min，将上清液吸取至新的EP 管中，即为总蛋白溶液。测定蛋白浓度并配平各组目的蛋白上样量。用SDS-PAGE 蛋白凝胶分离浓缩，切胶，转膜，封闭后，用1 ∶2000 稀释的Tom-20 抗体（Proteintech，美国）室温孵育1.5 h，二抗孵育后显色曝光。用BandScan 软件半定量分析条带，β-actin 作为内参以校正目的蛋白的表达量。

1.8 统计学方法

使用SPSS 24.0 统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（s）表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

与心衰组比较，RDN 后大鼠肾动脉外膜神经纤维明显减少。RDN 后各注药组肾动脉周围神经纤维数目由多到少依次为：NEP 组、RDN 组、Nogo-B 组（图1）。

图1 HE 染色（100×）

2.2 生化检查结果

与心衰组（0.877±0.412 nmol/g）比较，RDN 组[（4.325±1.855）nmol/g，t=3.143，P=0.035]、Nogo-B 组[（5.115±1.925）nmol/g，t=3.692，P=0，014]及NEP 组[（3.793±0.432）nmol/g，t=8.457，P=0.001]ATP 浓度均明显升高，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。RDN、Nogo-B 及NEP 三组间ATP 浓度差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

2.3 Western blot结果

与心衰组（0.148±0.053）比较，RDN 组（0.421±0.119，t=3.641，P=0.022）、Nogo-B 组（0.352±0.088，t=3.511，P=0.017）、NEP 组（0.401±0.123，t=3.262，P=0.031）心肌细胞Tom-20 表达量升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。RDN、Nogo-B 及NEP 三组间Tom-20 表达量差异无统计学意义（P＞ 0.05）（图2）。

图2 各组大鼠心肌细胞Tom-20 表达量的Western blot检测结果（以β-actin 作为内参）

3 讨论

RDN 主要通过降低交感神经活性起到降低血压、改善心功能的作用，有研究显示其还可降低RAS活性[1]、影响一些小分子生物活性物质的活性[9]，这些物质与心功能有着密切关系，但心衰时RDN 对心肌细胞线粒体功能的影响尚不明确。

线粒体是人体心肌细胞的主要产能部位，其功能异常与心衰密切相关[10]，ATP 是心肌细胞的主要供能物质。心肌细胞ATP 的产生主要依赖于脂肪酸氧化驱动的线粒体氧化磷酸化，少量依赖于葡萄糖氧化或糖酵解。在衰竭心脏中脂肪酸和葡萄糖氧化被抑制，而糖酵解不能为病变心脏提供足够的能量[11]，因此衰竭心脏心肌细胞中ATP 含量下降。本研究结果显示与未接受RDN 的心衰大鼠相比，RDN 组的大鼠心肌细胞ATP 含量明显上升，这可能与RDN 降低心衰大鼠全身交感神经兴奋性，心脏ATP 消耗减少有关。目前临床上常用的治疗心衰药物，如β 受体阻滞剂、ACEI、ARB 也可通过抑制交感神经活性减少心脏能量消耗，从而改善预后。

Tom-20 是线粒体外膜转运体Tom-40 复合物的转入受体，是线粒体蛋白运输系统的关键亚基，对线粒体蛋白导入的特异性起重要作用[4]。研究显示缺血会降低线粒体Tom-20 表达量，而缺血预处理可以维持Tom-20 的含量并通过改善线粒体的结构和功能来保护心脏[12]。此外，体外实验中过表达Tom-20 可减少ROS 生成，恢复线粒体功能，防止细胞死亡[13]。而衰竭心脏的心肌细胞中Tom-20 表达量降低[14]，本研究显示RDN 逆转了这一趋势，RDN组心肌细胞中Tom-20 表达量上调，显示RDN 可通过线粒体蛋白运输机制参与心肌保护。本研究推测心肌细胞Tom 表达水平的上升会增加线粒体某些蛋白的运输，从而改善心肌细胞线粒体的结构和功能。

研究显示RDN 后存在肾交感神经再生现象[15]，Nogo-B 是外周神经轴突生长抑制剂[8]，本研究采用对RDN 后的大鼠使用Nogo-B 的方法观察Nogo-B是否能抑制肾动脉交感神经再生。肾动脉的HE 染色结果显示RDN 后各注药组神经纤维数目为NEP组＞RDN 组＞Nogo-B 组，表 明RDN 后Nogo-B 抑制肾动脉神经纤维再生，NEP 促进肾动脉神经纤维再生。但生化检查及Western blot 结果显示各注药组大鼠心肌细胞ATP 含量及Tom-20 表达量差异无统计学意义，表明抑制RDN 后交感神经再生对线粒体功能无明显影响。这一结果出现的可能原因与样本量偏少或观察时间不够长有关，也有可能与RDN 后肾动脉周围神经纤维的再生只是解剖学再生，并非功能性再生有关[6]。

本研究显示，RDN 可以改善心衰大鼠心肌细胞线粒体功能，抑制RDN 后肾交感神经再生对慢性心衰大鼠心肌细胞线粒体功能无明显影响。由于本研究样本量偏少、观察时间不够长，有关RDN对心衰后心肌细胞线粒体功能的具体影响及其机制尚需进一步探讨。