从表达载体构建创新看基因工程考题变迁

邓自发　顾雨薇

摘 要：生命科学发展日新月异，尽管教材内容不会频繁变动，但秉承着“一核、四层、四翼”的高考试题常常围绕生物学科新发现、新成就创设情境，设置问题.尤其是基因工程部分，它更为贴近学科前沿.因此，本文结合教材与基因工程技术创新历程，围绕基因表达载体的构建分析模考与高考试题的变迁，尝试为高中生物学教学提供一定的参考.

关键词：基因工程；同源重组；高中生物

中图分类号：G632 文献标识码：A 文章编号：1008-0333（2023）16-0139-04

收稿日期：2023-03-05

作者简介：邓自发（1967-），男，陕西省镇安人，教授，从事生态学研究；

顾雨薇（1996-），女，江苏省南通人，从事中学生物学课程与教学论研究.

基金项目：江苏省一流本科专业（生物科学）建设项目；生物科学专业“卓越教师”教学技能培养研究与实践（南通大学教学改革项目）

基因工程，诞生于20世纪70年代，以它为核心的技术及相关产业一直是研究的热点.这些年来针对现实不同的需求或是操作，基因工程取得了不少技术创新和优化.现有的教材中介绍的是传统的表达载体构建，但是通过对以往的高考和模考试题分析，会发现高考的情境从不回避前沿知识.研读高考评价体系，能清楚发现，在高考评价体系“四翼”的应用性就明确要求高考要多以贴近时代、贴近社会、贴近生活的生活实践或学习探索问题情境为载体，将陈述性知识与程序性知识的有机整合和运用作为考查目标，体现对即将进入高等学校的学习者迁移课堂所学内容、理论联系实际水平的测量与评价^[1].所以，在此笔者以基因工程中的核心基因表达载体的构建为主体，通过整理它技术路线的变迁来探究试题变化趋势.

1 基因表达载体构建技术变迁

1.1 传统表达载体构建

基因工程又叫重组DNA技术，在现有人教版高中生物教材中介绍的基本工具是限制性内切核酸酶——“分子手术刀”、DNA连接酶——“分子缝合针”、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”.并且后续介绍基因工程的核心构建表达载体时，仍然遵循着最初的思路即利用限制酶和DNA连接酶将目的基因和表达载体相连.因此在传统的基因表达载体构建中限制酶的选取是基因工程这类题目的考察重点，并围绕真实科研中遇到的问题设置题目考察学生的科学思维等核心素养.

例题1 （2022·山东模拟）图1是获取用于构建基因表达载体的含人生长激素基因的DNA片段（DNA复制子链延伸方向是5′→3′，转录方向为左→右）示意图，图2是所用质粒示意图，其上的Ampr表示青霉素抗性基因，Tett表示四环素抗性基因.有关限制酶的识别序列和酶切位点见表1.

（1）引物1由5′→3′的碱基序列为，引物2应含有限制酶的识别序列

（2）在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成种环状DNA.答案：AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ 6

解析 分析题目所给的四种限制酶，其中BamH Ⅰ和Bcl Ⅱ属于同尾酶，它们虽然识别的序列不同，但切出的粘性末端相同.构建基因表达载体时，不能使用Hind Ⅲ和Pst Ⅰ，它们识别的序列位于目的基因的内部会切断目的基因，只能选择BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ.由于目的基因两侧没有合适的酶切序列，所以需要利用PCR技术，在引物设计上注意添加限制酶的识别序列，由于子链的延伸是由5′→3′的方向，所以3′端是用来连接新的游离的脱氧核糖核苷酸不能添加与目的基因本身不碱基互补配对的限制酶序列，而要在5′端加入.并且由于目的基因的插入是有方向的，反向接入没有意义，所以按照题目，Bgl Ⅱ限制酶的识别序列应该接在引物1上，而BamH Ⅰ的酶切序列则加在引物2的5′端.

由于BamH Ⅰ和Bcl Ⅱ属于同尾酶，所以尽管用了2种酶但是切出了相同的黏性末端.质粒完全酶切后会产生2个片段，且产生的4个黏性末端与DNA酶切后的两个黏性末端都能够碱基互补配对，所以在混入了DNA连接酶后，仅考虑片段的相连的话会有6种.

总结：①限制酶的选择要注意以下几点：

针对目的基因：不能够破环目的基因本身，否则连接毫无意义，因此往往要选取目的基因两侧的限制酶切割位点.

针对质粒：因为要与目的基因相连所以要确保产生同种黏性末端即切割质粒和目的基因的限制酶一般是同种.若没有同种酶则考虑同尾酶（识别序列不同但产生相同的黏性末端.其次限制酶的选择不能破坏质粒中的重要元件，包括复制原点、启动子、终止子，且选择启动子和终止子之间的限制酶；否則就没办法复制和正常表达.有时质粒上有多个标记基因，此时标记基因可以破坏，但必须注意保留一个以便后续目的基因的筛选和鉴定.

②单酶切与双酶切的选择：

单酶切有可能使目的基因和质粒的自身环化，也可能导致目的基因反向插入质粒，因此可以使用双酶切，让目的基因两端带有不同的黏性末端，避免自身环化，使目的基因定向插入质粒.

③目的基因两侧添加合适的酶切序列：

有的时候目的基因两侧并没有较好的限制酶的酶切位点，所以需要在利用PCR技术扩增目的基因时在引物设计上注意，适当地在引物的5′端带有限制酶酶切序列.

1.2 EASY法构建表达载体

除了利用限制酶和DNA连接酶来连接2个DNA片段，随着研究的发展，1990年，科学家舒曼在牛痘病毒中发现了1种拓扑异构酶，它的生理作用主要体现在DNA复制的过程中，同时具有内切酶和连接酶的功能：酶切释放DNA复制过程中因为解旋而带来的产生的螺旋力；在复制完成后，将缺口补上，完成DNA的复制，是DNA正常复制的重要保障.因此基于这一原理，科学家尝试将拓扑异构酶应用于基因表达载体的构建.在2019年江苏高考就应用了这个科研结果作为背景.

例题2 （2019·江苏高考）图3中是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tet^r）和氨苄青霉素抗性基因（amp^r）.请回答下面问题：

用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有1个腺嘌呤脱氧核苷酸.载体P1用酶处理，在两端各添加了1个碱基为的脱氧核苷酸.

答案：胸腺嘧啶（T）

分析 根据碱基互补配对原则，由于题干介绍目的基因两侧突出的末端都是以腺嘌呤为碱基的脱氧核糖核苷酸，所以在处理质粒时也需要让它的两端各添加1个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，方便目的基因与载体的连接.

EASY克隆主要原理是将胸腺嘧啶通过磷酸键与拓扑异构酶第274位酪氨酸结合，使拓扑异构酶和载体偶联在一起.当偶联载体与PCR产物进行连接时，PCR产物3′端羟基撞击载体与酶之间的磷酸键，使其断裂，拓扑异构酶利用断键释放的能量发挥连接功能，将片段连接到载体上，同时酶从载体上脱落.这项技术的广泛应用主要得益于拓扑异构酶本身的特性，它连接速度非常快，所以EASY法构建表达载体会更简便，反应更快速，连接更高效.不过由于它的原理并不在生物高中课程标准中要求学生理解的概念中，所以围绕这项技术考查的题目较少，多作为情境出现，并且出题角度依旧从学生已知角度出发，解决常见问题.

1.3 同源重组构建基因表达载体

传统基因表达载体的构建中应用双酶切法的很多，但是在实际操作中会遇到很多问题，比如效率问题.不同的限制酶它的最适温度可能不一样，它们所需要的缓冲液的成分也不一定相同，因此很有可能会导致最后酶切效率低下或者及连接效率不高，使得筛选重组目的基因非常困难，导致基因工程的失败.当然为了解决这个问题，越来越多的基因公司改造天然质粒，开发出了带有合适限制酶的质粒，但是如果基因工程需要用到特殊载体，这些问题又重新出现，因此人们通过研究传统的基因敲除的方法，将同源重组法应用在了基因表达载体的构建.它逐渐成为了近几年基因工程考题的情境.

例题3 （2021·江苏高考）如图4所示，某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下面问题：

重组质粒的构建

①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进，形成A-m结合体.将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及酶等，完成质粒的环化.

②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位點可能在______.

答案：黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处、基因m的内部

解析 这道题目是经典的同源重组构建基因表达载体中的无缝克隆.

第一步，将质粒线性化.在本道题里质粒上存在Sma I的酶切位点，直接利用Sma I切出平末端使得环状质粒线性化.当让如果质粒上没有合适的位点，也可以利用PCR方法实现载体的线性化.

第二步，获取目的基因.利用PCR扩增目的基因，并在两个引物的5′端添加与线性化质粒末端相同的同源序列.

第三步，将质粒与目的基因混合并添加双链的核酸外切酶.该酶具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸的作用，主要的催化活性是催化双链DNA按3′→5′的方向.

这样形成黏性末端，然后降温以促进黏性末端碱基配对.这一过程要控制酶解时间，时间过短，没有将同源序列的一条链全部水解，那目的基因和质粒产生的黏性末端是无法碱基互补配对的，时间可以过长，虽然可能会水解超过同源序列的部分，但不妨碍目的基因与质粒同源序列间的碱基互补序列.

第四步，导入大肠杆菌.刚刚提到在第三步中构建的载体并不完整，还可能存在部分脱氧核苷酸的缺失，但是导入了大肠杆菌后，细胞中本来就存在的DNA聚合酶和DNA连接酶能够将基因表达载体补全并连接完整.

总结：同源重组法构建基因表达载体对于学生来说是一个非常崭新的领域，并不是需要学生在平时学习就掌握的内容，更多的是试题提供背景信息，学生在有限的时间里，阅读题干，迅速了解同源重组的流程和结果，并利用已知来解决问题，考查的是学生的科学思维.学生应该掌握生物新课程标准中要求的基本概念，并能够灵活运用于新的情境，学会迁移而不是机械地死记硬背.2 思考与总结

基因工程应用广泛，它的诞生实现了在微生物、植物、动物之间的基因交流，让人类以前不能实现的种种奇思妙想变为了现实可能.它的原理看似简单，就是将外源基因成功导入到受体细胞，并且这个外源基因能够成功在受体细胞中稳定存在、表达并发挥作用，进而赋予生物新的遗传特性，但其实从理论研究到工程实践却并不简单.通过对表达载体构建技术的发展结合相关试题的研究，发现面对真实科研情境，书本上的传统操作过程会出现很多问题，学生要学会的是在掌握基础知识的前提下，开拓思维，利用已有知识尝试解决问题从而优化相关技术.

当然基因工程技术的革新不仅仅局限于基因表达载体的构建上，比如在目的基因获取中，以前书本主要是从基因文库中获取，但是在新教材中PCR法扩增成为主流.试题也更多地开始考查不同的PCR技术，比如RT—PCR、巢式PCR、重叠延伸PCR、热启动PCR等等.在目的基因导入受体细胞中，花粉管通道法和农杆菌转化法的共同使用；在目的基因的鉴定中，融合基因的应用都出现在了多个考题的情境中，总的来说生物学与生活实际是息息相关的，如果生物的学习仅仅停留在背书来答题，教师的教法仅仅是题海战术，那就完全违背了高考立德树人的目的.所以在教学时教学时，教师要以“理解为先”为目标，多关注科学前沿，适当给学生拓展，并在平时课堂上自己通过大量文献阅读设计情境引导学生培养批判性思维、创新性思维，提高学生生物核心素养.

参考文献：

[1] 欧阳一鸣.从高考题看生物论文信息题的命制方式：以2021天津卷13题为例[J].理科考试研究，2022，29（07）：63-65.

[责任编辑：季春阳]