高效液相法测定酱油中色氨酸含量

郑雪雪，谢春江，张 辉，黄 鹏，次仁拉姆，格桑央宗

（1.合肥市计量测试研究院，安徽合肥 230088；2.山南市市场监督管理局，西藏山南 856000）

酱油，俗称豉油，一般由大豆、小麦、食盐等原料经制油、发酵等工序制作而成。酱油中成分较多，包括食用盐、氨基酸、糖类、有机酸类和各种色素等，以咸味为主，伴有鲜、香等味道，为常见的调味品，能提升菜肴味道，改变菜肴色泽[1-5]。

色氨酸为人体必需氨基酸，为酱油产品质量标准的一个重要指标。色氨酸通过螯合反应与食品中微量金属离子有机结合，得到具有理化性质稳定、生物活性较高的有机螯合物[6]。

目前，文献报道的关于色氨酸含量的测定方法主要有氨基酸分析仪法、衍生色谱法、凯氏定氮法等[7-14]。氨基酸自动分析仪存在价格较贵、分析时间过长等不足，且单一波长扫描，定性的准确性存在问题；衍生色谱法需合适的衍生剂与样品反应，分析效率较低，且衍生剂一般价格较高。凯氏定氮法则是通过间接测定氨基酸中氮含量来折算氨基酸含量，分析过程较复杂，分析结果准确性不高。在检测色氨酸含量时，为提高分析检测灵敏度，现有的高效液相色谱法通常将色氨酸衍生后进行色谱分析，色氨酸的衍生步骤复杂，衍生试剂昂贵。因此，本研究开发出一种操作简便、经济、灵敏度高和结果可靠的检测方法，可用于酱油中色氨酸含量的测定，为保障市场酱油品质提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-色氨酸标准品（美国Sigma 公司）；氢氧化钠（分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

LC-20A 高效液相色谱仪（二极管阵列检测器Photo-Diode Array，PDA），日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液、试剂的配制

①1 000 μg·mL-1L-色氨酸标准储备溶液。准确称取L-色氨酸标准品10 mg 于10 mL 容量瓶中，用水溶解，定容，摇匀，4 ℃下避光保存。②L-色氨酸标准工作液。分别准确移取L-色氨酸标准储备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL 和1.0 mL 到10 mL 容量瓶中，纯水溶解，定容，得到系列标准工作液的浓度分别为10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1，4 ℃保存。③0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液。称取0.4 g 氢氧化钠，溶解于100 mL水中。④Na+浓度0.01 mol·L-1，pH=4.5 的乙酸钠缓冲溶液。称取0.82 g 无水乙酸钠，溶解于1 000 mL水中，冰醋酸调节pH 值至4.5。流动相为乙酸钠缓冲溶液∶甲醇=90 ∶10（V∶V）。

1.3.2 样品前处理

称取0.2 g酱油样品于蛋白质水解管中，加1.0 mL氢氧化钠溶液，振摇混匀，充氮气1 min，密封，放入（110±2）℃的烘箱水解22 h，取出水解管，冷却至室温，用乙酸钠缓冲溶液将水解液定量转移至50 mL 容量瓶中，用乙酸钠缓冲溶液定容，过膜，上机分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；最大吸收波长：278 nm；流动相：乙酸钠缓冲溶液（pH=4.5），甲醇；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：35 ℃。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

流动相为乙酸钠缓冲液-甲醇，比较甲醇比例为5%、8%、10%、15%和20%（V/V）的5 种流动相，发现甲醇比例超过10%会出现盐析现象，且色氨酸出峰处干扰较大，流动相中甲醇含量偏低则会导致分析时间过长。综合考虑，选择甲醇比例为10%（V/V）的流动相。

比 较 不 同 浓 度（0 mol·L-1、0.001 mol·L-1、0.005 mol·L-1、0.010 mol·L-1和0.020 mol·L-1）的乙酸钠缓冲液（pH=4.5）对色氨酸出峰效果的影响，结果显示，当乙酸钠浓度达到0.01 mol·L-1时，色氨酸的分离效果佳，峰形较好。随着乙酸钠浓度的降低，色氨酸出峰处有杂质峰干扰，峰形较差，最终采用0.01 mol·L-1的乙酸钠缓冲盐体系作为流动相中的水相。

2.2 流动相pH 值的选择

pH 值对出峰状况及灵敏度存在一定影响，实验比较了不同pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和5.5）的乙酸钠-乙酸缓冲体系对色氨酸色谱峰分离效果的影响。结果表明，随着流动相pH 值的降低，色氨酸出峰时间后移，导致分析时间过长。当pH 值为4.5 时，色氨酸达到分离要求，峰形相对较好。随着pH 值的降低，分离效果更好，但加入流动相中的乙酸含量大幅增加，长期使用会大大缩短色谱柱的使用寿命。当pH 值降至4.5 以下时，样品中杂峰对色氨酸的检测产生一定干扰。因此，将乙酸钠-乙酸缓冲体系的pH 值定为4.5。

2.3 柱温对色谱分离的影响

随着色谱柱柱温的升高，出峰时间将会缩短，30 ～40 ℃考察柱温对色谱分离的影响。当柱温低于35 ℃时，对色氨酸的检测有干扰；柱温高于35 ℃时，出峰越来越快，分离效果逐渐下降，容易被杂质峰干扰。综合考虑，最终设定35 ℃作为该实验柱温。

2.4 水解条件的选择

色氨酸在酸水解条件下结构容易被破坏，一般选择碱水解方式。以空白样品为基质，添加相同质量的大豆蛋白质，1.0 mL（0.01 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1、0.20 mol·L-1和0.50 mol·L-1）的氢氧化钠溶液110 ℃水解22 h，比较目标物的峰面积。图1表明，色氨酸的峰面积随水解浓度的增加而增大，氢氧化钠溶液浓度为0.10 mol·L-1时，色氨酸的峰面积趋于平稳，表明大豆蛋白质中酰胺键完全断裂，完全水解。因此，本实验选用0.10 mol·L-1氢氧化钠溶液水解蛋白质。

图1 水解浓度条件的影响

2.5 方法学考察

2.5.1 标准谱图和曲线线性关系

在设定色谱条件下，采用HPLC-PAD 分析，色氨酸峰形良好，如图2。选择280 nm 为色氨酸的最大吸收峰，该波长下灵敏度高，干扰小。在色氨酸浓度为10 ～100 μg·mL-1下，以峰面积为Y轴，色氨酸浓度为X轴做标准曲线，线性方程为Y=35 182.4X，具有良好线性关系，相关系数大于0.999。

图2 色氨酸标准品液相色谱图

选取合适浓度的L-色氨酸标准溶液进样分析，观察噪音强度，计算出3 倍信噪比（S/N），将其作为检出限，稀释L-色氨酸标准溶液，使其在仪器上响应强度为3 倍噪音值，得到L-色氨酸检出限为0.003 g·kg-1。稀释L-色氨酸标准溶液，使其响应强度为10 倍噪音值，将10 倍信噪比（S/N）作为定量限，得到L-色氨酸的定量限为0.01 g·kg-1，试验结果表明所建方法灵敏度较高。

2.5.2 加标回收率及精密度

称取18 份空白酱油样品，分别加入低、中、高（定量限、2 倍定量限、10 倍定量限）浓度的L-色氨酸标准溶液，依据1.3.2 处理，外标法定量并计算加标回收率、相对标准偏差，结果见表1。结果表明，该方法重现性好，回收率较高，适用于酱油中色氨酸的测定。色氨酸精密度小于10%，可以满足检测要求。

表1 色氨酸在不同浓度条件下的加标回收率（n=6）

2.5.3 样品检测

随机网购10 份酱油，按照本实验方法检测，结果显示8 份酱油中检出色氨酸，检出率80%，但含量存在一定差别。在酱油生产过程中，色氨酸结构可能遭到了破坏，故有产品未检出色氨酸。

3 结论

本研究优化了碱水解条件，选用乙酸钠-乙酸缓冲体系作为水相流动相，甲醇作为有机相流动相，提高了检测效率，增强了色氨酸的检测灵敏度。通过优化水相流动相的pH 值以及柱温，改善了色氨酸的分离效果。本研究建立的方法具有灵敏度高、重现性好等优点，适用于酱油中色氨酸的检测。