饮食习惯与日本人群肝癌风险的因果关系*

陈鹏宇 黄荷 朱兴旺 李汛,2,3

(1.兰州大学第一临床医学院,甘肃 兰州 730000;2.兰州大学第一医院普外科,甘肃 兰州 730000;3.甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室,甘肃 兰州 730000)

肝癌具有高发病率,其在男性和女性中分别占癌症总发病率的6.3%和3.0%。在致死率方面, 分别占总死亡率的10.5%和5.7%。在一些亚洲国家,如蒙古国、泰国和柬埔寨,肝癌是最常诊断的癌症,也是癌症死亡的主要原因[1]。HBV和HCV感染、黄曲霉素污染的食物、吸烟、高酒精摄入、肥胖及糖尿病是肝癌的高风险因素[2]。 健康的饮食可以减少癌症风险[3]。目前的流行病学证据支持饮食在肝癌发展中的重要作用,研究发现摄入咖啡[4]、鱼[5]和绿茶[6]可能会降低肝癌风险。随着大规模全基因组关联分析究(Genome-wide Association Study, GWASs)的不断增加,MR方法作为一种有效的流行病学工具,已被用于对不同表型进行因果推断[7]。通过使用遗传变异作为工具变量,MR可以克服传统观察性研究中反向因果关系的干扰并且最大限度地减少混杂因素[8]。Deng[9]探讨不同饮食习惯和肝癌的潜在因果关系,他们认为饮酒与肝癌风险增加呈正相关。相反,饮用咖啡与肝癌发生呈反比。Yun[10]评估肉类摄入与消化道癌症的因果效应,结果表明加工肉类摄入与结肠直肠癌的风险增加有关,不能得到红肉和白肉的摄入与消化道癌症风险增加有关。

随着现代饮食的改变,健康负担逐渐由感染性疾病转移到代谢性疾病以及肿瘤发病, 研究[11]已证明代谢性疾病,如糖尿病,非酒精性脂肪肝等在肝癌的发病方面具有显著的促进作用,但是并没有明确现代饮食对于肝癌发病的影响。因此,本研究使用基因代理的不同饮食习惯,用双样本的MR方法探讨不同饮食习惯和日本人群肝癌发生的因果关系。

1 资料与方法

1.1 研究设计 本研究利用公开可获取的GWASs来进行感兴趣的暴露(饮食习惯)和结局(肝癌)之间的因果关系推断。研究的所有人群主要限制于日本人群。以IVW法作为主要的方法,同时用多个敏感性检测方法来确保结果的可靠性。

1.2 数据来源 从UK Biobank获取了不同饮食习惯的GWASs数据(茶摄入、熟食蔬菜摄入、猪肉摄入、干果摄入、谷物摄入、加工肉摄入、家禽摄入、面包摄入、使用的牛奶种类、羊肉/牛羊肉摄入、水摄入、饮酒者状况、鱼油摄入)。食物摄入量是由参与者的每日摄入量决定的。所有参与者完成了食物频率调查表,来了解过去一年的食物摄入量。参与者必须对每种食物的摄入选择“从不”到“每天一次或更多”,不规则饮食习惯的参与者被排除。 编码内容包括以下:每周少于一次,每周一次,每周2～4次,每周5～6次,每天一次或以上,不知道以及不愿意回答。家庭调查表记录了关于食物摄入频率的详细数据(https://biobank.ndph.ox.ac.uk/ukb/label.cgi?id=100052)。肝癌的GWASs数据从日本生物银行(Biobank Japan)获取,总共包含了1866个肝癌病人和195745个对照组的数据 。

1.3 工具变量提取 为了获取与不同饮食习惯显著相关的(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,设置了P<5e-6的阈值,通常来说,工具变量的筛选的条件为P<5e-8。但本研究为了纳入更多的工具变量,设置了一个宽松的阈值,这个阈值在以往的研究中也经常被使用到[12]。 为了减弱不同SNP位点的连锁不平衡,设置了r2<0.001,窗口大小kb=10000的筛选条件。为了避免弱工具变量偏倚,本研究计算了每个SNP的F值(F=β2/se2),F值大于10被认为是一个强的工具变量[13]。

1.4 统计学分析 本研究使用IVW、MR-Egger、加权中位数,加权众数法和简单众数法的方法进行因果推断[14]。IVW对单个SNP的Wald比值进行荟萃分析,并假定遗传变异只能通过感兴趣的暴露而不是通过其他途径影响结果[15]。MR-Egger和加权中位数可以补充IVW[16]。简单众数法对SNP位点进行聚类。加权模式通过引入权重,对聚类的贡献度进行加权[17]。在敏感性分析中,Cochran's Q统计来检测异质性,采用MR-Egger回归、MR-Pleiotropy残差和离群点方法来检测多效性。MR-Egger回归方法中的截距被认为是存在多效性的标志,以P<0.05为差异有统计学意义。MR-Pleiotropy Residual Sum and Outlier methods (MR-PRESSO)方法可以检测离群SNP位点的存在。采用留一法来检测因果推断是否会被某一特定SNP位点影响。R2来评估SNP位点所解释的变异程度(R2=2×(1-MAF)×MAF×β2)。采用F统计量来计算工具变量的强弱程度(β是SNP的系数,MAF是小等位基因频率,se是系数的标准误差)。对每个纳入研究的SNP位点,在Pheo Scanner网站排除和混杂因素相关的SNP位点[18]。本研究进行的所有的MR分析都是在R(version 4.2.1)中进行的并用“TwoSampleMR” 包(version 0.5.6)[7]和“MRPRESSO” 包(version 1.0)[19]进行分析。

2 结果

2.1 工具变量 本研究用SNP位点代理的暴露揭示不同饮食习惯和日本人群肝癌发生的因果关联。通过筛选,研究得到了和不同饮食习惯显著相关且彼此独立的SNP位点,在结局中提取SNP位点信息并且协同了SNP位点在暴露和结局中的信息。移除了回文序列、不兼容的SNP位点、离群的SNP位点以及和混杂因素有关的SNP位点。HBV和HCV感染、黄曲霉素污染的食物、吸烟、高酒精摄入、肥胖和糖尿病是肝癌的高危因素,因此,在PheoScanner网站查询,如果纳入研究的SNP位点和这些高危因素有关则剔除。 对于剩余的SNP位点,计算每个SNP位点的F值。结果表明,本研究中纳入的SNP位点都是强工具变量。部分SNP位点基本信息,见表1。

表1 与不同饮食摄入有关的SNP位点信息Table 1 Information on SNP loci associated with different dietary intake

2.2 两样本MR分析 本研究用五种方法来揭露不同饮食习惯和日本人群肝癌发生的因果关系。作为主要的因果推断方法,IVW方法得到了面包的摄入会增加肝癌患病的风险(IVW:面包摄入OR:1.32,95%CI:1.09-1.60,P=0.004),用加权中位数的方法也得到了相同的结论(加权中位数:面包摄入OR:1.40,95%CI:1.09-1.80,P=0.01),但是用其他3种方法并没有得出相同的结论。用IVW方法没有得到其他不同饮食习惯和肝癌具有因果关联,其他方法也得到了相同的结论,见表2。

表2 不同饮食摄入与日本人群肝癌的MR结果Table 2 MR estimations of different dietary intakes on liver cancer in Japan population

在面包摄入和肝癌因果推断的MR分析中,异质性和多效性不存在(P>0.05)(见表2)。留一法的结果表明,面包摄入和日本人群肝癌发生的因果推断具有稳健性(见图1 A)。散点图表明了用不同的因果推断方法揭露了代表面包摄入的饮食习惯的SNP位点对日本人群肝癌发生的影响趋势(见图1B)。 森林图表示了单个的SNP位点在面包摄入与肝癌风险因果推断中的效力,见图1C。

图1 面包摄入与肝癌低风险因果推断的留一法敏感性分析、数点图、森林图Figure 1 Leave-one-out sensitivity analysis, dot plots, and forest plots for causal inference of the association between bread infake and low risk of liver cancer注:A.面包摄入与肝癌风险因果推断的留一法敏感性分析;B.面包摄入与肝癌风险因果推断的散点图;C.面包摄入与肝癌风险因果推断的森林图。

3 讨论

随着生活方式和饮食习惯的改变, 肝癌的发病率也在逐年提高。由于肥胖、 饮酒和糖尿病作为肝癌的高危因素,饮食在肝癌的发生中可能起到一定的作用。本研究使用两样本孟德尔的方法来揭露不同饮食习惯和日本人群中肝癌发生的因果关系。研究发现,增加面包的摄入可能增加日本人群罹患肝癌的风险。

本研究表明,面包摄入与肝癌风险增加呈正相关。Hosseini[20]利用标准化的问卷采访了242例肺癌患者和484例对照组,他们认为面包摄入是伊朗人群中罹患肺癌的一个危险因素。本研究中2/3的参与者摄入的面包种类为全谷物面包,而研究也分析了谷物摄入和肝癌风险增加的因果关联,可研究并没有得到谷物摄入和肝癌风险增加的因果关系。因此,面包摄入会增加肝癌的风险而谷物摄入和肝癌风险增加无关的原因可能为:①面包通常缺乏麸皮。由于大部分抗氧化剂都存在于谷类食品的麸皮中,因此去除麸皮可能会消除这些食品对癌症的预防作用。有研究[21]表明,精制谷物与上呼吸道癌症的风险直接相关,而全谷物谷类被发现具有保护作用。用麸皮中的阿魏酸处理的HepG2细胞,处于S期的细胞百分比显著增加,细胞凋亡和自噬的生物标志物也显著增加[22]。②面包中含有大量的糖类。研究[23]发现,在HBV阳性组中,血葡萄 糖水平处于第四个四分位数的受试者的原发性肝癌的风险增加。胰岛素抵抗是糖尿病患者中高血糖的一个主要原因。与糖尿病相关的胰岛素抵抗可能会上调胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factors -1, IGF-1)的产生,它刺激细胞增殖和抑制肝脏内的细胞凋亡[24]。此外,胰岛素抵抗导致促炎症细胞因子的水平升高,例如肿瘤坏死因子和白细胞介素-6,这有利于肝脏脂肪变性和炎症的发展以及随后肝癌的产生[25]。③这种作用可能由非酒精性脂肪肝介导的。研究表明,长期食用精制谷物与非酒精性脂肪肝风险的增加显著相关(OR:3.36;95%CI;1.44-7.87),而后者又是肝癌发生的一个常见危险因素[26]。非酒精性脂肪肝中致癌机制的非常复杂,如慢性炎症和高胰岛素血症,可导致较高的肝癌风险,特别是在有基础的糖尿病患者中。

两项队列研究发现较高的乳制品总摄入量(每天三份或更多)和更高的肝癌发生风险有关,而多饮用酸奶则与较低的风险有关,并且这些关联在没有HBV和HCV感染的患者中仍然存在[27]。乳制品和肝癌风险关联的潜在生物机制可能在于循环中的IGF-1。摄入大量乳制品可能增加血浆IGF-1的水平[28]。研究[29]证 实,IGF-1可能导致肝癌的发生。以蔬菜为基础的饮食习惯与较低的肝癌风险有关[30],研究表明总纤维和植物纤维(特别是谷类纤维)与较低的肝癌风险有关,而水果纤维似乎与肝癌风险无关[31]。与水果纤维相比,谷物纤维已经被一致认为与癌症的发生有较低的关联[32]。一个可能的原因是水果汁含有糖或添加糖(果糖和蔗糖),这可能导致肝脏损伤和非酒精性脂肪肝从而掩盖了纤维摄入的好处。鱼的摄入已被证明可以降低癌症风险[5],这可能是由于鱼存在的长链n-3多不饱和脂肪酸。大量的实验研究表明,n-3 多不饱和脂肪酸具有抗炎活性,可以抑制IL-1和TNF的合成[33],这有助于预防肝癌的发生。此外,包括鱼和家禽在内的白肉是丰富的支链氨基酸来源。支链氨基酸能加速胰岛素诱导的血管内皮生长因子mRNA的降解,在肝癌的发展过程中下调血管内皮生长因子的表达[34]。支链氨基酸还可以通过雷帕霉素靶蛋白复合体依赖的途径抑制胰岛素诱导的PI3K/Akt途径来诱导肝癌细胞的凋亡[35]。研究[36]表明,绿茶与肝癌风险之间有显著的反向关系(RR:0.79,95%CI:0.68～0.93)。然而,一项病例对照研究[37]显示,尿液中较高的儿茶素水平可能不会降低而会增加肝癌的发病风险。 在本研究中,我们并没有得到乳制品、熟食蔬菜、鱼油和绿茶与肝癌发生的因果关系。

研究表明,肉类摄入与癌症风险有关。 一项meta分析[38]表明,食用红肉与肝癌的风险无关(RR: 1.04;95%CI:0.91～1.18;P: 0.033)。然而,较高的加工肉的膳食摄入可能会增加肝癌的风险(RR:1.20;95%CI: 1.02～1.41;P:0.228)。相反,白肉的摄入与肝癌的风险呈反比关系(RR:0.76;95%CI:0.63～0.92;P:0.001)。加工肉制品增加肝癌风险的潜在机制尚不明确,可能是由以下途径介导的:①多项研究证实致癌物质,如多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)、杂环胺(Heterocyclic amines, HCAs)、N-亚硝基化合物(N-nitroso compounds, NOCs)和血红素铁是在加工肉类时产生的。肉类中的肌酸和肌酐在高温加工过程中会产生HCAs,并且随着温度和时间的增加会产生更多的HCAs。HCAs被代谢激活,诱发DNA序列突变并促进细胞增殖,从而导致癌症[39]。②细胞色素P450酶诱导PAHs,与DNA共价结合,促进DNA序列的变异[40]。③不仅高温加工可以产生NOCs,而且肉类中的血红素铁也能诱发内源性合成NOCs和遗传毒性的自由基[41]。在本研究中,并没有得到加工肉、白肉(家禽)和红肉(牛羊肉)的摄入与日本人群肝癌风险增加有关。这与Yun[10]探讨肉类摄入与欧洲人群消化道癌症风险之间的因果关系,但并没有得到肉类摄入增加与肝癌风险增加有关的结果一致。

本研究利用MR来揭示不同的饮食习惯和日本人群中肝癌发生的因果关系,但大多数暴露和结局之间并没有得到相应的因果关联。可能原因如下:①本研究的研究人群主要是日本血统,有关日本人群研究的GWASs的样本量过小。②纳入本研究的饮食习惯和日本人群肝癌的发生可能根本上就没有因果关联。以往的观察性研究得出的结论很可能没有较好的控制混杂因素。③不同研究对表型的定义不一样。

4 结论

本研究认为面包的摄入会增加日本人群肝癌患病的风险。 但这需要更大样本量的GWASs数据来证实。