体外和体内研究表明松茸提取物可降低色素沉着

王一鸣 安全 杨杨 霍彤 邵雪 权强华

关键词：松茸；色素沉着；酪氨酸酶活性；转录组测序

在人类皮肤中，黑色素在表皮底层的黑色素细胞中合成，是抵御紫外线引起的皮肤损伤的重要保护元件[1， 2]。虽然黑色素能够吸收紫外线，刺激皮肤生长来保护暴露在阳光下的皮肤，但黑色素过量聚集则会导致皮肤产生色斑、色素过度沉着等皮肤问题。酪氨酸酶以及酪氨酸酶相关蛋白1（TRP-1） 和酪氨酸酶相关蛋白质2（TRP-2） 作为参与黑色素生物合成的主要酶，其酶活性与黑色素生成密切相关[3， 4]。在皮肤色素沉着相关的抑制剂研究中，是否能够调控酪氨酸酶活性是研究黑色素生成过程的重要方向[5，6]。目前熊果苷、曲酸和维生素衍生物多被用作改善皮肤色素沉着的成分。然而，由于安全性问题，如嗜铬症、萎缩癌变和其他局部或全身的副作用，使得天然药用植物资源代替皮肤色素沉着抑制剂成为护肤品研究关注的重点领域[7-10]。

松茸（Tricholoma matsutake，TM） 是一种外生菌根共生真菌，属于松茸亚属，也是一种非常重要的食用菌，营养丰富，味道鲜美。之前研究表明松茸多糖具有多种免疫刺激活性[11]、抗肿瘤活性[12]、抗氧化活性[13]、造血活性和抗突变活性[14，15]。在中国和日本等亚洲国家，松茸被用于疾病的预防和治疗已有1000 多年历史[15-21]。然而，目前还没有关于松茸在改善色素沉着过度方面的全面性功能性研究。

因此，本研究探讨了松茸提取物对B16-F10 黑色素瘤细胞的黑色素合成、酪氨酸酶活性的影响。通过建立动物皮肤色素沉着模型，进一步研究松茸对肤色调节的作用。随后，为了确定松茸提取物对人类皮肤色素沉着的影响，检测了34 名受试者在使用了松茸提取物后皮肤颜色和光泽改善情况。最后为了探索松茸提取物潜在的抗色素沉着机制，对UVB 刺激和松茸提取物处理后的B16-F10 细胞进行了转录组测序分析。

01实验部分

1.1 主要试剂

含有10%（v/v） 胎牛血清（FBS） 和1% 鏈霉素—青霉素的细胞培养基（DMEM） 购自GIBCO Invitrogen。磷酸盐缓冲溶液购自康宁公司。蘑菇酪氨酸酶和l-3，4- 二羟基苯丙氨酸（L-DOPA） 购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 制备松茸提取物

松茸在100℃去离子水中提取，随后用H1O3 大孔吸附树脂和40% 乙醇纯化。

1.2.2 细胞培养

小鼠黑色素瘤B16-F10 细胞在DMEM 培养基中进行培养，并在37℃的5%CO2 培养箱中保存。

1.2.3 细胞活力测定

利用CCK-8 测定法测量松茸提取物诱导后的B16-F10 细胞增殖水平。首先将细胞接种于DMEM 的96孔板中并培养24 h。随后将松茸提取物加入细胞中培养24 h，将10 μL 的CCK-8 溶液添加到每个孔中孵育1 小时并测量细胞在490 nm 处的细胞活力。

1.2.4 动物实验

实验方案经辽宁中医药大学动物实验伦理委员会批准（SCXK Liao 2015-0001）。C57BL/6 雄性小鼠购自辽宁昌盛生物科技有限公司。饲养条件：温度20 ～ 24℃；相对湿度55% ～ 65%；昼夜12 h-12 h；可自由进食饮水。小鼠每天暴露于330 mJ/cm2 的UVB 辐射，持续15 天。实验前将小鼠背部区域电剪刀剃毛（面积均为2 cm×2cm），随后用0.2%、0.5%、1% 的松茸提取物和3% 的熊果苷对小鼠背部皮肤进行局部给药，每天两次，持续40 天。

1.2.5 B16-F10 的黑色素含量和酪氨酸酶活性测定

B16-F10 细胞在37 ℃ 和5%CO2 的培养箱中培养24h。在加入50 μM 的8-MOP（8- 甲氧补骨脂素） 之前，用松茸提取物预处理细胞6h。24h 后丢弃上清液，并用1 mL PBS 洗涤两次。使用1 mL 1 moL/L NaOH（含有10%DMSO） 溶解B16-F10 细胞中的黑色素，测定490nm 处吸光度。

1.2.6 小鼠皮肤的黑色素含量测定

在松茸提取物和熊果苷处理后的40 天，使用多功能皮肤UV 分析仪（ES-3100） 检测小鼠背部皮肤的黑色素指数。

1.2.7 小鼠皮肤的酪氨酸酶含量测定

向小鼠腹膜内注射三溴乙醇（240 mg/kg） 进行麻醉，取背部皮肤，并进行精确称重和匀浆，通过TYRELISA试剂盒测定匀浆中酪氨酸酶的含量。每组3 个重复，取平均值。

1.2.8 志愿者指标采集

研究得到了北京中德联合化妆品研究所的批准，所有志愿者都充分了解了实验的目的并签署了知情同意书。对34 名女性（44 ～ 55 岁） 进行了自身对照研究，评估松茸提取物改善面部皮肤肤色的能力。受试者每晚使用含有松茸提取物的面膜共4 周，测试期间，受试者保持原有的清洁护肤方式、习惯和品牌不变，停用自己的面膜。

1.2.9 人脸皮肤颜色和光泽测定

在22±2℃和50%±5% 湿度环境下检测皮肤颜色和光泽度。志愿者洗脸30 分钟后，使用MPA-580（CK，德国） 的Chromeeter CR-400 和Glossymeter GL200 的探头检测皮肤颜色和光泽度检测每个受试者的皮肤状态。检测时间分别为试验前、试验后2 周和试验后4 周。

1.2.10 转录组分析

本研究对UVB 刺激和松茸提取物处理后的B16-F10细胞进行了高通量转录组测序和生物信息学分析，为进一步了解松茸提取物抗紫外机制。以P 值<0.01，|log2FC|>2为标准，筛选8-MOP 处理前后细胞显著差异表达基因。随后对上调和下调的显著差异表达基因进行通路富集分析，包括解析其相关潜在靶点在生物过程（PB）、分子功能（MF） 和细胞成分（CC） 中的作用。

1.2.11 统计分析

使用GraphPad Prism 7.0 版软件进行统计分析。数据以平均值的平均标准误差（SEM） 表示，在P 值<0.05 时，数值差异被认为是显著的。

02结果

2.1 松茸提取物抑制B16-F10 细胞中酪氨酸酶的活性，从而抑制黑色素生成

通过CCK-8 检测细胞活性以确定松茸提取物的最佳处理浓度。与对照组相比，在较高浓度1 mg/mL 松茸提取物的刺激下未观察到细胞毒性（见图2A）。通过测量B16-F10 细胞的黑色素含量发现，以8-MOP 刺激B16-F10 细胞作为黑色素生成模型组，模型组的黑色素含量为对照组的117.54%（p <0.01），高于空白组、加入熊果苷处理的阳性对照组和加入松茸提取物处理组（见图2B）。如图2C 所示，松茸提取物以剂量依赖的方式抑制酪氨酸酶活性，与对照组和空白组相比，松茸处理组和阳性对照组的酪氨酸酶活性均显著下降。

2.2 松茸提取物对动物皮肤具有美白作用

以上結果表明，松茸提取物可以通过抑制B16-F10中的酪氨酸酶活性，从而抑制黑色素的生成。为了确定松茸提取物对小鼠皮肤色素沉着过度的影响，随后检测暴露于UVB 后小鼠的黑色素指数变化情况。空白组小鼠的黑色素指数为3.34，暴露于UVB 15 天后，UVB 处理组的小鼠黑色素指数增至5.04。在熊果苷以及0.2%、0.5%、1%的松茸提取物处理40 天后，黑色素指数分别降至4.585和4.615、3.67、3.04（见图3A）。并且1% 浓度的松茸提取物对色素沉着过度的修复功效优于熊果苷。

如图3B 所示，空白组小鼠的酪氨酸酶含量最初为1.28ng/mL，暴露于UVB 15 天后增加到2.54 ng/mL。然而，在熊果苷、0.2%、0.5% 和1% 的松茸提取物处理40 天后，酪氨酸酶含量分别降至1.3、1.85、1.815 和1.59 ng/mL。

2.3 松茸提取物对人体皮肤具有美白作用

上述研究表明，松茸提取物可以抑制B16-F10 和小鼠皮肤中黑色素的产生。为了进一步确定松茸对人类皮肤色素沉着过度的美白修复功效，检测受试者使用含有松茸提取物的面膜后，皮肤白皙程度以及光泽度改善情况。L* 值用来表征皮肤亮度，L* 值越大，代表皮肤颜色越白；ITA°值用来表征人体皮肤颜色，ITA°值越大，代表皮肤颜色越浅。如图4A 所示，随着松茸提取物的处理时间的增加，L*/ITA°值也随之增加。除此之外，皮肤的光泽度也随着松茸提取物的使用时间增加而增加。实验结果表明松茸提取物能够起到提亮肤色美白的效果。

2.4 GO 和KEGG 通路分析

通过分析不同组间的转录组数据，筛选出了3631 个差异表达基因（DEG），其中1876 个基因上调，1755 个基因下调（见图5A）。通过更严格的筛选标准（|logFC|>2，P <0. 05），筛选出841 个差异表达基因（包括144 个上调基因和697 个下调基因） 进行后续的通路富集分析。

GO 术语富集分析发现，上调的DEG 在14 个GOBP、8 个GO-MF 和10 个GO-CC 中显著富集，对细胞质、肌动蛋白细胞骨架、相同蛋白结合、镁离子结合、凋亡过程和碳水化合物代谢过程的正调控；下调的DEG 在92 个GO-BP、49 个GO-MF 和44 个GO-CC 中显著富集，对PML 体、染色体、着丝粒区、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II 转录因子活性、细胞迁移的调节呈正向调控。差异表达基因显著富集的KEGG 通路数据的结果也如图5C 所示。上调的基因显著富集了2 条与色素沉着相关的KEGG 通路，包括P13/Akt 信号通路和MAPK 信号通路。

2.5 蛋白质互作网络分析

将松茸处理后得到的差异蛋白列表导入Cytoscape软件中，以构建分析其蛋白在生物系统中的相互作用关系网络。在分析松茸处理的靶向互作网络中有841 个蛋白质映射到模型网络中的78 个节点（见图6A） 以及拓扑分析（见图6B） 后发现，Ndufs6、Ndufs5、Rpl4、RplB、Rps5、Rps3、Rps18、Rps11、Rps9、Rps14、Psmb7、Psmb2、Psmb4 和Psmb6 可以作为重要的交互基因参与黑色素以及酪氨酸酶活性的调控过程。

03讨论

松茸作为一种非常重要的食用菌，1000 多年来一直在医学领域被广泛应用。最近的一项研究表明，肉桂酸甲酯是松茸的重要成分之一，可抑制小鼠B16-F10 黑色素瘤细胞中的酶促反应和黑色素的生成，表明肉桂酸甲酯可能作为一种新的黑色素生成抑制剂[22]。然而，这项研究仅使用黑色素瘤细胞来评估肉桂酸甲酯对黑色素生成的影响，研究并不全面。此外，肉桂酸甲酯与熊果苷和曲酸具有相同的安全问题。因此，该项研究通过分析松茸这类药用植物资源，探究植物提取物对皮肤色素沉着抑制的功效。

酪氨酸酶是黑色素生物合成的限速酶，在调节黑色素生成，酪氨酸酶在黑色素生成中发挥重要作用[23]。之前研究表明Phytoclear-EL1 大戟种子提取物，能够降低B16-F10 黑色素瘤细胞的黑色素含量和酪氨酸酶活性[24]。当归提取物以剂量依赖的方式显著降低了B16-F10 中的黑色素含量和酪氨酸酶活性，可能也是一种潜在的抗色素沉着剂[25]。因此在本实验中，我们也选择B16-F10 细胞检测了松茸提取物黑色素含量和酪氨酸酶活性的影响。实验结果发现松茸提取物显著抑制B16-F10 细胞中黑色素的形成。此外，研究结果发现松茸提取物以比熊果苷更好的剂量依赖性方式抑制B16-F10 细胞中的酪氨酸酶活性。总之，松茸提取物可以通过抑制B16-F10 细胞中的酪氨酸酶活性来抑制黑色素的形成，并且可以作为改善色素沉着的重要自然植物资源。

随后通过动物实验，评估松茸提取物是否能够抑制暴露于UVB 后的动物皮肤色素沉着。紫外线是影响皮肤黑色素类型和数量的主要外在因素。UVB 照射角质形成细胞增加了POMC（α-MSH 前体） 的表达和受体MC1-R 的表达，导致形成α-MSH、黑色素合成酶和其他信号因子表达的激活[26，27]。通过暴露于UVB 后的小鼠构建了动物皮肤的色素沉着模型，我们发现松茸提取物能够抑制黑色素的形成并改善动物皮肤的过度色素沉着。随后人体皮肤实验结果表明，使用含有松茸提取物的产品后4 周发现，松茸对人体皮肤美白具有显著效果。以上结果表明松茸提取物能够改善小鼠皮肤和人类皮肤的色素沉着。

为了确定调控黑色素生成的关键基因和调控途径并阐明松茸调控的分子机制，我们使用RNA 测序来分析完整的转录组。RNA 测序分析表明，松茸提取物可以影响色素沉着调控相关通路，主要作用于P13K/Akt 信号通路和MAPK 信号通路。MITF 的表达受cAMP 调节，cAMP 抑制PI3K 并刺激GSK-β 活性[28]。此外，GSK-β 刺激MITF磷酸化，增强了色素相关基因的转录激活和黑色素的合成[29，30]。在环己酰亚胺存在的情况下，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK） 激酶抑制MITF 的表达，从而使细胞外信号调节激酶（ERK）/MAPK 信号传导参与MITF 的降解。在该调控途径中，配体- 受体相互作用激活Ras 蛋白，从而进一步激活B-Raf 激酶和ERK1/2。MAPK 能够磷酸化MITF 蛋白，导致MITF 的泛素化和降解，黑色素生成相关基因的表达降低[31]。此外，PPI 结果表明，松茸提取物可能通过黑色素细胞的增殖和凋亡来调节色素沉着。

综上所述，通过体外B16-F10 细胞培养、UVB 诱导的小鼠皮肤色素沉着，以及人类皮肤中的皮肤美白效果发现，松茸提取物具有调控色素沉着、酪氨酸酶活性方面的功效。转录组测序分析发现松茸提取物可以通过调节P13K/Akt 信号通路和MAPK 信号通路来改善色素沉着过度，并与黑色素生成以及黑色素瘤的增殖和凋亡有关。