基于微分段技术分析单根头发中42 种精神活性物质

纪佼佼，徐多麒，向平，严慧，沈敏

1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.复旦大学基础医学院，上海 200032

药物辅助犯罪（drug-facilitated crime，DFC）是一个总称，包括受精神药物影响实施的强奸或其他形式的性侵犯、抢劫、勒索钱财以及故意虐待老人或儿童的犯罪行为[1]。药物辅助性犯罪（drug-facilitated sexual assault，DFSA）是药物辅助犯罪案件的一个子集，在DFSA 案件中，具有精神活性的药物被用来改变一个人的意识和行为，从而实施性犯罪，涉及的物质主要包括乙醇、γ-羟基丁酸、苯二氮䓬类药物、非苯二氮䓬类新型镇静安眠药物（Z-药物）等[2-4]。然而，DFSA 案件给法医毒物学者带来了挑战，因为从案发到检测通常经历时间较长，且这类案件药物剂量较低，随着体内代谢的消除，药物在血液和尿液中无法检出[5]。为了延长检测窗口，毛发分析已成为法医毒物学和临床毒理学领域解决DFSA 案件必不可少的技术手段[6-7]。

根据头发的长度，头发中药物的检测时限可达几周或几个月。此外，对头发样本中精神活性物质的分段分析可以对药物摄入史进行评估，并且区分长期及单次用药。在常规的头发分段分析中，通常是将束发剪成1～2 cm 的片段，将同一片段的头发合并为一个样本，以10～20 mg 的样本量进行分析[8-9]。然而，这种常规毛发分段分析的时间分辨率仅处于月水平而无法对药物摄入时间进行更精确的估计[10]。根据头发1 cm/月的生长速度，若对单根头发采用以对应的日生长长度0.4 mm 为单位的更为精细的微分段分析，可以减少多余空白头发基质对药物的稀释作用，并且可以将估计摄药时间的分辨率提高到日水平[11]。

在既往研究[12]中，本课题组应用两个DFSA 案例比较了毛发微分段分析与常规的1 cm 分段分析方法，结果表明，微分段分析可以提高毛发中药物检测的实用性，增强DFSA案件的证据力。近年来，基质辅助激光解吸电离-质谱成像（matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）技术由于其高分辨率、可原位分析、结果可视化等优势，在单根头发的药物分布研究中受到广泛关注[13-15]。然而，液相色谱-串联质谱（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对生物样品中药物定性和定量分析的灵敏度要优于MALDI-MSI[16]。因此，采用LC-MS/MS 法能够实现对于亚毫米头发片段中的药物检测和分析。本研究旨在建立一种覆盖42种常见精神活性物质的单根头发微分段分析方法并应用于单次服用唑吡坦的志愿者头发样本，以探究单根头发微分段分析方法在解决DFSA案件中的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

QTRAP 6500+三重四极杆线性离子阱复合质谱系统（美国AB Sciex 公司）配备AcquityTMUltra performance LC I-CLASS 超高效液相色谱仪（美国Waters公司），SB-2200-T 超声波清洗仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

42 种精神活性物质及3 种内标的标准溶液均为质量浓度为1 mg/mL 的甲醇溶液。苯海拉明、地芬尼多、东莨菪碱、安替比林购于上海安谱实验科技股份有限公司，苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮、吗啡、O6-单乙酰吗啡、可卡因、苯甲酰爱康宁、麦角二乙胺、芬太尼、氟硝西泮、7-氨基氟硝西泮、三唑仑、α-羟基三唑仑、可待因、地西泮、去甲地西泮、替马西泮、奥沙西泮、阿普唑仑、α-羟基阿普唑仑、氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮、艾司唑仑、劳拉西泮、咪达唑仑、硝西泮、7-氨基硝西泮、唑吡坦、西酞普兰、右美沙芬、氯氮平、右美托咪定、曲马多、卡马西平、奥卡西平、尼美西泮、喹硫平、米氮平以及3 种内标（氯胺酮-d4，地西泮-d5，喹硫平-d8）的对照品购自美国Cerilliant 公司，思诺思酒石酸唑吡坦片（10 mg，含10 mg 酒石酸唑吡坦/片）购自赛诺菲（杭州）制药有限公司。二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、甲醇（色谱纯）和乙腈（色谱纯）购自美国Sigma-Aldrich 公司，98%甲酸溶液和98%乙酸铵溶液购自瑞士Fluka 公司，超纯水由Milli-Q Advantage A10 超纯水系统（美国Millipore 公司）制备。

1.2 溶液配制

1.2.1 混合标准物质工作液配制

取42 种精神活性物质的标准物质适量，加入甲醇配制成质量浓度为1 μg/mL 的混合标准物质工作液。随后用甲醇稀释成质量浓度为16～40 000 pg/mL的混合工作溶液。

1.2.2 混合内标工作液配制

取3 种内标对照品适量，加入甲醇配制成质量浓度为10 μg/mL 的混合内标工作液。随后用甲醇稀释成质量浓度为0.5 ng/mL 的混合内标工作溶液。

所有工作溶液在使用前均置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 提取溶液配制

毛发提取介质为V甲醇∶V乙腈∶V2mmol/L甲酸铵（8%乙腈，pH=5.3）=25∶25∶50 的混合物。提取溶剂为将DTT 溶解于毛发提取介质（extraction medium，EM）溶液中制备成的质量浓度为10 mg/mL 的DTT-EM 溶液。

1.3 样本来源

空白头发样本采集自10 名未摄入上述精神活性物质的健康志愿者，用于制备校正曲线及质量控制样品。

志愿者头发样本（黑色，8 cm）来自一名本实验室工作人员（女性，32 岁），在本研究之前未服用过精神药品，在本研究中单次服用唑吡坦后28 d，用镊子从后枕部拔取5 根头发，标记根部，4 ℃保存供分析。

本研究已通过司法鉴定科学研究院伦理委员会审批，实验前告知志愿者药物实验风险并签署知情同意书。

1.4 样本前处理

用去离子水和丙酮擦拭头发样本，以避免外部污染干扰分析，室温下干燥。然后将单根头发粘在胶带上，用外科手术剪刀在30 倍的放大镜下将其剪成长0.4 mm 的片段，该长度与头发每日的生长长度[17]大致一致。将每个0.4 mm 的头发片段置于200 μL 的微量离心管中，加入5 μL 内标和20 μL DTT-EM 溶液，超声1 h，浸泡20 h。取上清液供LC-MS/MS 分析。对于实验头发样本，将5 根头发的近根端2 cm 分成50 段0.4 mm 的片段，标记为S1、S2……S50，并按照上述方法进行提取。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱为Allure PFPP 柱（100 mm×2.1 mm，5 μm；美国Restek 公司）。流动相A 为20 mmol/L 乙酸铵、0.1%甲酸和5%乙腈的水溶液，流动相B 为乙腈。采用线性梯度洗脱，洗脱程序见表1。自动进样器温度为4 ℃，进样量为10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.5.2 质谱条件

采用电喷雾离子源正离子（positive electrospray ionization，ESI+）模式，在多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式下采集数据。ESI 参数设置如下：离子源温度450 ℃；气帘气（N2）30 psi；离子喷射电压5 500 V，碰撞室出口电压10 V、入口电压10 V；离子源气体1（GS1）35 psi，离子源气体2（GS2）35 psi。MRM 参数和保留时间见表2。

表2 42 种精神活性物质及3 种内标的MRM 参数和保留时间Tab.2 MRM parameters and retention times for 42 psychoactive substances and 3 internal standard substances

1.6 方法学验证

1.6.1 选择性

取10 份不同来源的空白头发样品，分别按照1.4 节方法进行样品前处理，考察头发样品中的内源性物质是否干扰42 种精神活性物质的测定。

1.6.2 线性、检出限和定量限

校准曲线范围从每个化合物的最低定量限到500 pg/mm。将工作溶液添加到空白的单根0.4 mm 头发片段中，配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、250 和500 pg/mm 的加标头发样品，并对每个校准水平进行3 次重复评估。以每个分析物的浓度为横坐标（x），以定量离子对与内标的峰面积比为纵坐标（y），使用加权最小二乘法（1/x）进行回归计算获得曲线方程，相关系数（r）至少为0.99。以信噪比（S/N）≥3为检出限（limit of detection，LOD），以S/N≥10 且精密度的变异系数小于20%，准确度在80%和120%之间为最低定量限（lower limit of quantitation，LLOQ）[18]。

1.6.3 精密度和准确度

在0.4 mm 空白头发样品中加入42 种精神活性物质的混合工作溶液，配制成浓度为LLOQ 和250 pg/mm两个浓度的质量控制（quality control，QC）样品，每个浓度点制备6个平行样品，按照1.4节方法进行样本前处理，连续测定4 d。精密度用相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来评估。经线性方程计算的测定值与实际添加混合工作溶液的浓度的百分比为准确度。要求LLOQ 样品的精密度不超过20%，其余QC 样品的精密度不超过15%；LLOQ 样品的准确度在80%～120%，其余QC 样品的准确度在85%～115%[18]。

1.6.4 基质效应和提取回收率

按照MATUSZEWSKI 等[19]提出的方法考察基质效应和提取回收率。选取低浓度（LLOQ）和高浓度（250 pg/mm）作为QC浓度进行考察。将超声和浸泡处理前的加标头发样品中各化合物的峰面积记为SA，超声和浸泡处理后的加标头发样品中各化合物的峰面积记为SB，在相应浓度的纯标准溶液中各化合物的绝对峰面积记为SC。用生成峰面积SB/SC×100%计算基质效应，用生成峰面积SA/SB×100%计算提取回收率。

2 结果与讨论

2.1 微分段分析浓度单位的选择

关于单根头发微分段分析单位的选择，既往研究[20-21]中报道不一。由于0.4 mm的头发片段质量较小，实验室常规的称量设备无法直接对其质量进行精确称量。KUWAYAMA等[20]提出可以测量1根头发的长度并称量其质量，根据其质量从而估计每一段头发的平均质量。该研究对22根头发进行了称重并测量，0.4 mm头发片段的质量在2.29～6.42 μg。然而，WIEDFELD等[21]认为，即使根据头发片段的平均质量进行计算，个体间和个体内头发直径的差异也会影响浓度的准确性。此外，清洗、烫染和天气变化可能会增加头发角质层的损伤和降解，不同发丝间的含水量也可能不同，质量可能存在2～3 倍的差异。因此，以长度为单位对浓度的反映更为准确且方便。

2.2 方法学验证

2.2.1 选择性

10 份不同来源的空白头发样品经样品前处理后，在待测化合物对应的保留时间处均无内源性干扰以及内标的干扰，说明该方法的选择性良好。空白头发与空白头发添加20 pg/mm 42 种精神活性物质的色谱图见图1。

图1 空白头发（A）与空白头发添加20 pg/mm 42 种精神活性物质（B）的色谱图Fig.1 The chromatograms of hair collecting before administration（A）and 42 psychoactive substances spiked at 20 pg/mm（B）

2.2.2 线性、LOD 和LLOQ

本研究中所有化合物在各自线性范围内线性关系良好（r＞0.99）。LOD 为0.2～10 pg/mm，LLOQ 为0.5～20 pg/mm。在该方法覆盖的42 种化合物中，26 种物质（61.9%）的LLOQ≤5 pg/mm，8 种物质（19.0%）的LLOQ≤1 pg/mm。各化合物的回归方程、相关系数（r）、LOD 和LLOQ 见表3。

表3 头发中42 种精神活性物质的回归方程、相关系数（r）、LOD 和LLOQTab.3 Regression equation，correlation coefficient（r），LOD and LLOQ of 42 psychoactive substances in hair

2.2.3 精密度和准确度

本研究中各化合物的精密度和准确度见表4。该方法的日内精密度为1.5%～11.8%，日内准确度为86.5%～105.7%，日间精密度为2.8%～12.7%，日间准确度为88.2%～109.2%。精密度均在15%以内，准确度均在85%～115%，表明该方法的精密度和准确度良好。

表4 头发中42 种精神活性物质的精密度、准确度、回收率和基质效应Tab.4 Precision，accuracy，recovery and matrix effect of 42 psychoactive substances in hair （%）

2.2.4 提取回收率和基质效应

本研究中各化合物的提取回收率为68.1%～98.2%，基质效应为71.3%～111.7%，详见表4。

2.3 案例应用

运用本研究方法对单次服用1 片唑吡坦（含10 mg酒石酸唑吡坦/片）28 d 后的志愿者单根头发（实验样本）进行分析。结果显示，5 根头发中唑吡坦的检出位置位于S28～S40（近根端1.08～1.60 cm），浓度范围为0.62～20.5 pg/mm。单根头发中唑吡坦的总含量为47.2～72.1 pg，平均含量为56.9 pg（n=5），这一结果与之前的报道接近。SHIMA 等[22]对单次服用10 mg 酒石酸唑吡坦后35 d 的黑色头发进行分析，发现单根头发中含有的药物总含量范围为27～63 pg，平均含量为43 pg（n=14）。本例5 根头发中4 根的峰值浓度出现在S34（近根端1.36 cm），1 根头发的峰值浓度出现在S36（近根端1.44 cm），详见图2。根据已知的服药时间计算可知，该志愿者的头发生长速度为0.49～0.51 mm/d，约为1.5 cm/月，比通常认为的1 cm/月要快。因此，不同个体的头发生长速度存在差异。在药物辅助犯罪案件中，需要以个体本身头发的生长速度进行推算，以提高药物摄入时间估计的准确性。

图2 唑吡坦在5 根头发中的分布Fig.2 Distribution of zolpidem in 5 hairs

3 结论

本研究建立了0.4 mm 头发片段中42 种精神活性物质的LC-MS/MS 定性定量分析方法，并成功应用于单次服用唑吡坦的志愿者头发样本的分析，在5 根头发中均检出唑吡坦，表明头发微分段分析技术可用于唑吡坦单次摄药案件的检测。然而，同一个体的头发间可能处于不同的生长阶段[23]，在对案件结果进行分析和评价时，需要尽量基于多根头发的分析结果以排除操作误差及偶然性。此外，未来还需要将微分段分析技术应用于涉及更多药物的案例中，以进一步证明单根头发微分段分析技术在DFSA 案件中的可行性。