GnRH-a对不明原因反复种植失败患者冻融胚胎移植临床妊娠结局的影响

陈楠 周燕 张红艳 江美燕 林珍云 费小阳

尽管人类辅助生殖技术（assisted reproductive technologies，ART）已帮助无数家庭解决了不孕难题，但仍有约10%的患者表现为经历多次胚胎植入却最终妊娠失败，即反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）[1-2]。植入是人类生殖的关键步骤，成功的植入取决于胚胎和子宫内膜之间的相互作用[3]。RIF 是指多次胚胎移植后仍不能着床。不明原因RIF病因多而复杂，母体子宫内膜容受性不足和胚胎质量较差是引起RIF的主要原因[4]。冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）可以根据患者的具体情况选择合适的子宫内膜准备方案，准确把握子宫内膜“移植窗”的开放时间段，改善子宫内膜容受性，进而改善RIF 患者的妊娠结局[5]。目前FET 内膜准备方案最常见的有自然周期、人工周期方案、促排卵方案等[6]。促性腺激素释放激素激动剂（gonadotrophin releasing hormone agonist，GnRH-a）降调节联合人工周期方案：GnRH-a 降调节联合激素替代治疗（hormone replacement therapy，HRT）是子宫内膜异位症、子宫腺肌症患者内膜准备的首选方案，但其对RIF患者的有效性仍存在争议。本研究拟探讨GnRH-a-HRT 方案对不明原因RIF 患者FET 临床妊娠结局的影响，旨在为RIF患者提供一种更为有效的内膜准备方案，从而改善妊娠结局。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018 年1 月至2022 年12 月在杭州市妇产科医院生殖中心因不明原因RIF 再次行FET 的患者162 例为研究对象。纳入标准[7]：（1）年龄＜40 岁；（2）符合不明原因RIF 诊断标准：至少移植3 次或移植高评分卵裂期胚胎数4～6 个或高评分囊胚数3 个及以上均失败；（3）男女双方染色体无异常；（4）宫腔镜检查未见子宫内膜异常或宫腔形态异常；（5）有冷冻的卵裂期或囊胚期的胚胎，本次移植胚胎中至少有1 枚优质胚胎。排除标准：（1）合并有子宫内膜病变或通过手术宫腔形态无法恢复正常；（2）男女任何一方有染色体的异常；（3）合并输卵管积液未治疗；（4）合并有内外科疾病，如甲状腺功能异常、自身免疫性疾病、糖尿病等。其中内膜准备方案为GnRH-a 降调节联合HRT 81 例（GnRH-a-HRT 组）和单纯HRT 组81 例（HRT 组）。两组患者抗苗勒管激素（antimullerian hormone，AMH）、既往移植周期数、不孕病因比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而两组患者年龄、BMI、卵泡刺激素/促黄体生成素（follicle-stimulating hor‐mone/luteinizing hormone，FSH/LH）、不孕年限、不孕类型比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。本研究经本院医学伦理委员会审查通过[批准文号：2023 医伦审A 第（037）号]，所有患者均知情同意。

表1 不同内膜准备方案两组患者一般资料比较

1.2 内膜准备方案

1.2.1 HRT 周期方案 月经第3 天开始口服戊酸雌二醇（法国Delpharm Lille SAS，规格：1 mg/片，批号：H20160679）3 mg，2 次/d，间隔7 d 后根据内膜厚度调整戊酸雌二醇剂量。当子宫内膜厚度≥8 mm 时，开始内膜转化。转化方法：加用黄体酮针（浙江仙琚制药有限公司，规格：20 mg/支，批号：H33020828）40 mg，肌肉注射，2 次/d+地屈孕酮（荷兰Abbott Biologicals B.V.，规格：10 mg/片，批号：HJ20170221）20 mg 口服，2 次/d，内膜转化第4 天移植卵裂期胚胎，转化第6 天移植囊胚。

1.2.2 GnRH-a-HRT 方案 月经第2～3 天排除妊娠后皮下注射长效GnRH-a（上海丽珠制药有限公司，规格：3.75 mg，批号：H20093852）3.75 mg，28 d 后B 超检测子宫内膜厚度、双侧卵巢大小，测定性激素水平，达到垂体降调节标准：雌二醇（estradiol，E2）＜40 pg/L、LH＜5 U/L、子宫内膜厚度＜5 mm 时，开始HRT。内膜转化方法同HRT。

1.3 观察指标 包括转化日E2及孕酮水平、转化日内膜厚度、移植胚胎数、优质胚胎数、临床妊娠率、种植率、多胎率、异位妊娠率、流产率等。

1.4 妊娠评价 胚胎移植后12～14 d 查血β-人绒毛膜促性腺激素判断是否妊娠，移植后26～30 d 行阴道超声检查确认孕囊位置、胎心及胚胎数目，若探及孕囊及原始心管搏动者为临床妊娠；若孕囊≥2 个为多胎妊娠。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料组间比较采用χ2检验。采用多因素logistic 逐步回归分析影响临床妊娠结局的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者观察指标比较 GnRH-a-HRT 组患者转化日E2水平低于HRT 组，临床妊娠率高于HRT 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而两组患者转化日孕酮水平、转化日内膜厚度、移植胚胎数、优质胚胎数、种植率、多胎率、异位妊娠率、流产率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 两组患者观察指标比较

2.2 影响临床妊娠结局的多因素分析 以临床妊娠为因变量，以年龄、AMH、BMI、FSH/LH、不孕年限、GnRH-a 降调节治疗、既往移植周期数、移植胚胎数、优质胚胎数、转化日E2为自变量进行多因素logistic 逐步回归分析，结果显示GnRH-a 和转化日E2水平不是临床妊娠结局的影响因素（均P＞0.05），而女方年龄是临床妊娠结局的独立影响因素（P＜0.05），见表3。

表3 影响临床妊娠结局的多因素分析

3 讨论

对于原因明确的RIF 患者，治疗原发疾病是关键[8-9]。目前针对不明原因RIF 的发病机制仍存在很多争议，近年来研究主要集中在胚胎子宫内膜和免疫调节方面[10]。选择有种植潜能的胚胎、识别种植窗和保持子宫内膜容受性是胚胎种植的重要因素[11]。越来越多的证据表明选择FET 会提高胚胎种植率、改善妊娠结局，而选择合适的内膜准备方法变得尤为重要[12]。既往经典的FET 内膜准备方式主要包括自然周期、HRT 周期、促排卵周期等[13]。然而HRT 周期可通过外源性补充雌激素，机动调整内膜种植窗开放时间，灵活选择胚胎移植的时机，移植取消率大幅度降低，已成为目前FET 的主流内膜准备方案[14]。近年研究表明HRT 周期可以在GnRH-a 诱导垂体抑制的情况下进行，即在使用HRT 周期内膜准备前先予GnRH-a 预处理，可防止自发排卵和周期取消率，多用于子宫内膜异位症、子宫腺肌病、多囊卵巢综合征等[15-16]。但对于RIF 患者的有效性仍存在争议。

本研究显示GnRH-a 降调节后E2水平显著降低，临床妊娠率显著升高，但并不会增加多胎率、异位妊娠率、流产率的风险。表明GnRH-a-HRT 治疗较单纯HRT 可获得更高的临床妊娠率。而多因素logsitic 回归分析显示年龄是影响临床妊娠结局的独立影响因素，GnRH-a 预处理和转化日E2水平不是影响临床妊娠结局的因素，考虑年龄协同GnRH-a 影响临床妊娠结局。同时GnRH-a 降调节导致机体处于低雌激素水平的状态，这一状态可调节种植相关炎症细胞因子平衡状态，使内膜种植窗期开放时间延长，间接增加妊娠率。而高雌激素水平可能会显著缩短种植窗口期，降低胚胎种植率[17]。而降调节同时可增强子宫内膜avb3 整合素的表达，防止种植窗提前开放，提高子宫内膜容受性，改善妊娠结局[10]。由于本研究纳入样本量较少，需要进一步扩大样本量分析年龄、GnRH-a 预处理和转化日E2水平对临床妊娠结局的影响。Guo等[18]研究纳入了52 例行FET 治疗的RIF 患者，探究GnRH-a 对不明原因RIF 患者外周血中Th17/调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的影响，结果显示GnRHa 降调节可通过免疫调节逆转不明原因RIF 患者Th17/Treg 的细胞不平衡，改善内膜容受性，影响早期胚胎发育。Li 等[19]系统地评估GnRH-a-HRT 对FET 的影响，结果显示GnRH-a 预处理可改善胚胎植入率、临床妊娠率和活产率，特别是对RIF 的患者。GnRH-a 预处理可以改善FET 的妊娠结果，与本研究结果相同。而一项前瞻性随机对照研究纳入了133 例行HRT-FET 的患者，比较了GnRH-a-HRT 对FET 妊娠结局的影响。结果显示GnRH-a 组和对照组的临床妊娠率、种植率、活产率均无统计学差异，提示GnRH-a 预处理并不能改善FET 女性的妊娠结局[15]。但此研究并未对移植的胚胎类型进行分析。关于GnRH-a 对不明原因RIF 妊娠结局的影响仍较少研究。

综上所述，本研究结果显示经过GnRH-a-HRT 降调节可改善临床妊娠结局，但受女方年龄因素协同影响，并不增加多胎率、早期流产率、异位妊娠率的风险。然而本研究仍存在局限性，GnRH-a-HRT 降调节周期数较少，未对胚胎的类型、具体移植的数量进行分组分析，需进一步扩大样本量通过前瞻性研究探讨其对临床妊娠结局的影响。