基于超高效液相色谱与红外光谱的金银花药材产地溯源*

李籽杉,杜泽飞,杨晓,丁丰,夏从龙,周萍,段宝忠

(1.大理大学药学院,大理 671000;2.云南省北花农业发展有限公司,云龙 672700)

金银花为传统中药,来源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花[1],具清热解毒、疏风散热之功效,主要用于热毒血痢、风热感冒、咽喉肿痛等[2-3]。以其作为原料生产的成药有金银花露、银翘解毒片和双黄连口服液等,素有“中药青霉素”之称[4]。金银花含有酚酸类、黄酮类及萜类等多种成分[5-7],具有抗氧化、抗炎、抗菌及降血糖等药理活性[8-10]。金银花在我国种植广泛,其中河南封丘、山东平邑和河北巨鹿为金银花传统道地产区[11]。近年来随着市场需求不断增大,金银花栽培面积和种植地区日益扩大,在云南、甘肃等地有大量引种栽培。研究表明,药材质量受气候环境、海拔高度、采收期或种质等的影响,不同产区金银花样品化学成分等存在差异[12-16]。由于不同产区金银花加工后外形相似,仅凭肉眼难以区分,市场上以次充好、品种混淆等问题普遍存在[17],影响了金银花临床应用的有效性和安全性。因此,建立快速、准确的产地溯源方法,有助于实现金银花样品产地的快速识别,对保证金银花临床疗效和维护市场健康发展具有重要意义。

药用植物的产地溯源方法主要有红外光谱、分子标记以及稳定同位素、矿物元素、色谱指纹图谱等手段[18],其中红外光谱具有操作简单、分析快速、样品无耗损等特点[19],可间接反映样品中化学组成信息,在临床药物筛选、粮食作物和中药材的产地溯源以及质量控制等领域广泛应用[20-22]。色谱指纹图谱可从整体上表征复杂成分的特征性和相似性,已在芦荟[23]、草果[24]、玉竹[25]等中药材的质量评价领域广泛应用。目前,已有采用傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared,FTIR)对山东、河北、四川等产地,以及超高效液相色谱(ultra-high performance liquid chromatography,UPLC)指纹图谱对山东和河南产地金银花样品质量的评价研究[26-27],但笔者尚未见采用化学计量学方法探讨金银花产地溯源体系构建的相关研究,尤其是道地产区山东与新产区云南的差异未见报道。鉴于此,笔者在本研究采用FTIR和UPLC指纹图谱技术,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚类分析(hierachical cluster analysis,HCA)方法,对山东和云南产区金银花样品进行研究,以期为建立金银花样品产地溯源和资源合理开发利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1290型超高效液相色谱仪(二元梯度泵、DAD检测器)(美国 Agilent 公司),Nexus FTIR仪(Thermo Nicolet 380),AL204电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,感量:0.1 mg],FY135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司),SB25-12D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司),HW-3红外烘干箱(天津市光学仪器厂),FW-4A型粉末压片机(天津市拓普仪器有限公司),玛瑙研钵。

1.2试药 绿原酸(批号:MUST-12031401)和木犀草苷(批号:MUST-17121210)对照品购自成都曼思特生物科技有限公司,含量均≥98%。光谱级溴化钾单晶粉末(天津天光光学仪器有限公司,批号:170421),色谱级乙腈(Fisher Scientific,批号:085884),磷酸溶液,甲醇,其他试剂均为分析纯,水为超纯水。

40批金银花样品(表1),采集于云南省和山东省,经大理大学段宝忠教授鉴定为忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾,凭证标本保存于大理大学中药标本馆。

2 UPLC指纹图谱

2.1色谱条件 色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为乙腈(A)和0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱程序:0～5 min,12%→15% A;5～10 min,15%→24%A;10～15 min,24%→33%A;柱温35 ℃;检测波长350 nm;流速0.2 mL·min-1,进样量2 μL。在上述条件下,木犀草苷和绿原酸分离良好。

表1 金银花样品信息

2.2对照品溶液的制备 取绿原酸与木犀草苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成绿原酸和木犀草苷浓度约为0.2 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备 将不同品种金银花样品置于60 ℃干燥至恒重,粉碎过80目筛(筛孔内径0.178 mm),备用。分别取0.2 g,精密称定,置100 mL具塞锥形瓶,加入50%甲醇50 mL,称定质量,室温超声40 min,超声结束后加50%甲醇补足失重,摇匀,上清液过孔径0.45 μm滤膜,取续滤液,即得。

2.4精密度实验 取同一金银花供试品溶液(批号:S1),按“2.1”项色谱条件连续进样6次,记录色谱图,并对各共有峰保留时间和峰面积进行考察,计算得各共有峰保留时间的RSD为0.04%～0.62%,峰面积RSD为0.49%～1.61%,表明仪器精密度良好。

2.5重复性实验 取同一金银花样品(批号:S1)粉末0.2 g,精密称定6份,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件依次进样测定,记录色谱图,并对各共有峰保留时间和峰面积进行考察,计算得到各共有峰保留时间的RSD为0.04%～1.20%,峰面积RSD为0.50%～3.04%,表明该方法重复性良好。

2.6稳定性实验 取同一金银花供试品溶液(批号:S1),按“2.1”项色谱条件分别在0,2,4,8,12,24 h进样测定,记录色谱图,各共有峰保留时间RSD为0.04%～1.58%,峰面积RSD为0.69%～2.98%,提示供试品溶液24 h内基本稳定。

2.7线性关系考察 取“2.2”项绿原酸与木犀草苷混合对照品溶液,等比稀释成一系列浓度混合对照品溶液,按“2.1”项色谱条件测定峰面积。以色谱峰面积(Y)对进样浓度(X,μg·mL-1)进行线性回归,得回归方程分别为:绿原酸Y=1 176.9X-12.121(r=0.999 2),线性范围为0.023 0～0.230 mg·mL-1;木犀草苷Y=4 676.1X+75.601(r=0.999 2),线性范围为0.023 6～0.236 mg·mL-1。

2.8加样回收率实验 精密称取已知含量金银花样品(批号:S1)粉末,平行6份,分别精密加入一定量混合对照品溶液,按“2.3”项制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件进样,计算得绿原酸、木犀草苷加样回收率分别为99.60%,99.64%,RSD分别为0.71%,4.09%。

2.9样品含量及指纹图谱相似度分析 将40批金银花样品,按“2.3”项方法制备供试品溶液,进样记录各样品15 min色谱图,采用指纹图谱软件处理,共获得共有峰12个,通过对照品保留时间确认3号峰为绿原酸,8号峰为木犀草苷,色谱图见图1;各样品中绿原酸、木犀草苷含量及样品相似度计算结果见表2。含量分析显示,在40批金银花样品中,有5批样品(S18、S20、S21、S22、S29)绿原酸含量低于1.5%(表2),其中除S29以外,其余均为8月采收的“九丰一号”样品。之前的研究显示,“九丰一号”和“济草堂一号”两个金银花花蕾中的绿原酸和木犀草苷含量从5月到9月逐渐减少[28]。从木犀草苷含量看,不同月份采收的金银花样品有一定差异,在40批样品中,除S10和S22号样品外,仅7月采收的九丰一号(S12～S16)样品木犀草苷含量高于0.050%。综合2种指标成分含量测定结果,提示7月云南产区的“九丰一号”金银花有效成分积累达到最高,可能由于7月是云南产区雨季,且温度较高,此时具备金银花植物生长的最适气候。此外,相似度计算结果显示,40批样品与对照图谱的相似度均>0.90,表明不同产地及不同品种金银花样品色谱峰总体稳定。值得注意的是,虽然本研究提取方法与《中华人民共和国药典》(2020年版)相同,均为超声提取,但本研究提取的溶剂为50%甲醇,相比《中华人民共和国药典》(2020年版)采用75%甲醇,本实验的提取方法具有更多色谱峰,提供了更多的变量信息以利于产地溯源。然而本研究结果也显示,若按《中华人民共和国药典》(2020年版)金银花中绿原酸和木犀草苷含量的限值规定,本研究中大部分样品不符合要求,可能原因是提取溶剂影响了上述两种成分的提取效率,导致两种成分总量较低。在之前的研究中,李春燕等[29]发现在提取绿原酸时,醇提优于水提,可能原因是绿原酸含有羟基和邻二酚基,极性与醇相对接近,一定程度上解释了本研究的大部分样品两种成分的含量低于《中华人民共和国药典》(2020年版)规定限值的原因,这也是本研究的局限之一,有待进一步实验验证。

3.绿原酸;8.木犀草苷。

2.10系统聚类分析 将40批金银花样品共有峰相对于参比峰进行峰面积量化,得到40 × 12阶数据矩阵,采用SPSS 20.0版软件作聚类分析,选用Ward's法和欧氏距离法进行聚类分析,结果见图2。40批金银花样品可分为两大类,来自山东的样品S23～S30样品单独聚为一类;来自云南的样品聚为一类,云南产区不同品种无法实现有效区分;提示金银花药材质量受产地影响较大,而受品种影响相对较小。

2.11主成分分析 将40批金银花样品进行PCA分析,结果显示前两个主成分累积方差贡献率>90.60%,PCA得分图(图3)显示,40批样品分成2类,来自山东的金银花样品S23～S30单独聚为一类,产于云南的九丰一号S1～S22以及北花一号样品S31～S40聚为一类,PCA结果与HCA结果基本一致,表明基于PCA方法可实现不同产区金银花样品的识别,但无法区分同一产区的不同品种金银花。

3 红外光谱

3.1供试品的制备 取金银花样品粉末1.0 mg至玛瑙研钵中,加入溴化钾粉末200.0 mg作为分散剂,研磨均匀,取适量细粉平铺于模具中,并以20 MPa压强压制1 min,取出,对光检视,得到色泽均匀的透明锭片,备用。

3.2红外光谱条件 光谱扫描范围4000～400 cm-1,扫描32次,分辨率4 cm-1,扫描时实时扣除水(H2O)和二氧化碳(CO2)背景。

3.3数据分析 采用OMNIC 8.0版软件对光谱数据进行坐标归一化、基线校正、平滑(点数15)处理。HCA分析使用SPSS 20.0版软件,PCA分析使用SIMCA 13.0版软件,二阶导数采用Origin 8.5版软件计算后绘制曲线。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)进行相似度分析,参数设置为中位数法,时间窗宽度为0.1 min,自动匹配生成对照图谱。

3.4精密度实验 以同一金银花样品(批号:S1)为考察对象,按“3.2”项方法,连续重复扫描5次,所得红外图谱的相关系数在0.999 1～0.999 9,RSD为0.03%,表明精密度良好。

3.5重复性实验 取同一金银花供试品(批号:S1)5份,按“3.1”项方法分别压片,所得红外图谱的相关系数在0.998 8～0.999 6,RSD为0.06%,表明重复性良好。

3.6稳定性实验 取同一金银花供试品(批号:S1),分别在0,0.5,1,2,3,4,5 h,按“3.1”项方法进行测定,所得红外图谱的相关系数在0.980 8～0.998 6,RSD为0.7%,表明锭片在5 h内稳定性良好。

3.7金银花红外光谱比较分析 不同产地金银花平均红外光谱见图4,从图中可见,不同产地、不同品种及不同采收期金银花样品峰形、峰位基本一致,而强度有一定差异,表明所研究的金银花样品所含组分基本相同,积累量有一定差异。从样品平均IR图谱看,2800～3500 cm-1附近可能为烷基C-H对称伸缩振动和O-H伸缩振动吸收峰[30];1800～1500 cm-1处可能为酰胺Ⅰ带和Ⅱ带的特征C=O伸缩振动,以及苯环的特征吸收[31];1200～1000 cm-1处为多糖、皂苷等物质的混合振动吸收区[32]。上述特征峰与金银花样品中黄酮类、酚酸类等物质的结构吻合。

3.8红外光谱二阶导数比较分析 为更好地显示红外光谱图谱叠合蔽峰,本研究采用二阶导数处理后对金银花样品间差异进行了比较。在之前的研究中,邹婧等[33]采用红外光谱对金银花样品进行溯源研究,发现来自5个产地的金银花样品可明显区分,仅云南产地的样品二阶导数在3668 cm-1处有吸收峰,但该项研究用于建模的样品数量仅有1份,存在一定的局限性。本研究中,同一产地使用了多份样本重复,有效避免了由于偶然因素导致的误差。从二阶导数谱图(图5)可见,九丰一号在3000～2750 cm-1波段范围内,在2857和2921 cm-1处有吸收峰,而在北花一号样品中,无类似的“锯齿”吸收峰,据此可将两个品种进行区分。云南产九丰一号均在3250 cm-1附近有吸收峰,而山东产九丰一号中未发现3250 cm-1吸收峰,可将不同产区金银花样品区分。

表2 金银花指标成分含量测定及指纹图谱相似度评价结果

图2 金银花样品的UPLC聚类分析图(n=40)

图3 金银花样品UPLC主成分分析(n=40)

3.9层次聚类分析 将40批样品原始谱图进行二阶求导预处理,使用Ward's法和欧氏距离进行HCA分析,结果见图6。从图6可知,当判别距离为20时,样本被分为两类:第一类包括10批云南产北花一号(S31～S40);第二类包括30批九丰一号金银花样品,分别为8批山东产区(S23～S30)和22批云南产区(S1～S22);上述结果表明从IR二阶导数光谱数据来看,金银花样品品种对化学成分的影响大于产地。在判别条件距离为10时,8批山东产九丰一号、22批云南产九丰一号和10批云南产北花一号各自聚为一支,可明显区分,上述结果提示FTIR二阶导数光谱可用于不同品种和不同产地的金银花品种及产地溯源。

图4 不同品种、产地、采收期金银花红外光谱图

3.10主成分分析 PCA是一种无监督多变量数据分析法,其在不损失主要信息的前提下实现降维,扩大样本之间的差异,可解决由于中药成分复杂所致的谱带重叠分析困难[34]。将40批金银花样品红外光谱经自动基线校正+自动平滑+纵坐标归一化+二阶求导预处理后的数据,进行PCA分析,从PCA得分图(图7)可看出样品被分为3类,与HCA结果一致。

4 讨论

笔者在本研究中采用FTIR和UPLC结合化学计量学方法,对40批来自不同产地的金银花药材进行研究。结果表明,基于UPLC色谱可实现不同产区金银花产地溯源,但无法识别同一产区不同品种的样品,而FTIR光谱可实现金银花品种和产地溯源。鉴于不同产区或不同品种金银花在外形上的相似性,传统性状、显微和理化鉴定方法存在一定局限性,金银花样品的混用对临床用药造成了一定的安全隐患。红外光谱为多组分特征信息监测,对固态样品仅需研磨等简单预处理,可实现无损检测[35]。UPLC方法同时可实现有效成分含量的检测,结合多元统计方法可对样品的多元特征信息进行提取和分析,易培训和推广,为准确判别金银花的地理来源提供了一种新的客观快速的方法,有望应用于市场监督领域,本研究为新方法的构建提供了参考。

A.云南产九丰一号(5月);B.云南产九丰一号(6月);C.山东产九丰一号(5月);D.云南产九丰一号(7月);E.云南产北花一号(5月);F.云南产九丰一号(8月)。

图6 不同品种和不同产地金银花红外光谱聚类分析图(n=40)

图7 不同品种和不同产地金银花红外光谱主成分分析图(n=40)