不同干燥方法对醋制延胡索物性及成分溶出的影响

宋丹妮,窦志英,范天慈,孙佳惠,张莹,董妍玉,宋洪伟

(1.天津中医药大学,天津市中药化学与分析重点实验室,天津 301617;2.天津医学高等专科学校,天津 300222;3.江苏省徐州市中医院药剂科,徐州 221000)

延胡索为罂粟科Papaveraceae紫堇属CorydalisDC.植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎,其性温,味辛、苦,归心、肝、脾经,具有活血、散瘀、行气、镇痛功效。临床常使用其醋制品,用于治疗胸肋脘腹疼痛、胸痹心痛和跌打肿痛等[1]。

中药材质量除与产地、采收时间有关外,干燥是一个重要的影响因素[2]。前期研究发现,煮制或蒸制后延胡索中淀粉粒糊化,质地变硬角质样,因此有必要对延胡索干燥方法进行研究,并对其机制进行探讨。近年来,传统和现代干燥原理与技术的干燥方法逐渐应用于中药材产地干燥加工,常用的中药材现代干燥技术主要有热风干燥(烘干)、真空冷冻干燥、真空干燥等[3]。目前研究多针对不同干燥方法对成分含量的影响,对物性和成分溶出影响的报道笔者较少见到。硬度、折干率、复水率等因素是综合反映药材质量的重要特征[4]。临床上中药煎煮多采用水提法,成分溶出与《中华人民共和国药典》中浓氨-甲醇混合溶液提取有差异。因此,有必要对醋制延胡索干燥后物性参数和成分在水煎煮过程中的溶出规律进行考察,寻找醋制延胡索适宜的干燥方式。

笔者在本实验通过测定延胡索乙素、四氢非洲防己碱、去氢紫堇碱、四氢黄连碱、原阿片碱、非洲防己碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀等8种生物碱的溶出量,结合多个外观特征指标,采用化学计量学综合评价药材质量,探究晒干、烘干、真空干燥和真空冷冻干燥 4 种不同干燥方法对药材物性和内部成分溶出速度与程度的影响。

1 仪器与试药

1.1仪器 DHG-9245A 型电热鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司),DZF-6020 型真空干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司),LGJ-12 型真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司),GY-4型数显式水果硬度仪(浙江托普仪器有限公司), 超高效液相色谱仪(UPLC)(Agilent 1290),ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司),KQ-250E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),FA2004电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司,感量:0.000 1 g);DV215CD型电子天平(奥豪斯仪器有限公司,感量:0.000 01 g);离心机(北京时代北利离心机有限公司,型号:DT5-2);FW100 高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2药品与试剂 四氢非洲防己碱(批号:W12N7Z24780,含量≥95%)、四氢黄连碱(批号:R18A6F2,含量≥98%)、非洲防己碱(批号:W30M7Z15501,含量≥98%)、盐酸小檗碱(批号:Y21A7S13543,含量≥98%)均购自上海源叶生物科技有限供公司;盐酸巴马汀(批号:110732-201611,含量:86.8%)购自中国食品药品检定研究院;延胡索乙素(批号:W05-5-8,含量≥98.0%)、去氢紫堇碱(批号:W14-2-4,含量≥98.0%)、原阿片碱(批号:W14-2-6,含量≥98.0%)均购自Zhongxin InnovaLaboratories;醋[食品级,天津市天立独流老醋股份有限公司,总酸含量≥3.50 g·(100 mL)-1,以乙酸计],乙腈(色谱纯,默克股份两合公司),甲醇(分析纯,天津市化学试剂供销公司),甲酸(Anaquachemicals supply),氨水(分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司),纯化水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。延胡索购于浙江省台州市仙居县朱溪镇,经天津中医药大学中药鉴定教研室马琳教授鉴定为罂粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的干燥块茎,样品保存于天津中医药大学中药学院炮制科研实验室。

2 实验方法

2.1醋延胡索样品的制备 取鲜品延胡索,去除杂质,大小分档,直径>1 cm为大个延胡索,直径<1 cm为小个延胡索。洗净,切厚片,稍晾,加入适量醋,拌润待醋液被吸尽后,分别按以下方法进行干燥加工处理。置电热鼓风机干燥(HAD);置日光下晒干(SD);置真空干燥箱内干燥(VD);置于-20 ℃冰箱真空冷冻干燥 24 h。物料冻实后,快速将其平铺于已预冷的真空冷冻干燥机腔体内的物料架上进行真空冷冻干燥(FD)。见表1。

表1 醋制延胡索样品与干燥方法

2.2复水率计算公式 RR=Mf/Mg,式中RR为复水率,Mf为干品复水沥干后的质量(g),Mg为复水前干品的质量(g)。其中料水比为1：10,每种样品重复4 次,取平均值[5]。

2.3折干率 折干率=(干燥后质量/干燥前质量)×100%[5]。

2.4硬度 GY-4型数显式水果硬度仪测定样品硬度,每种样品重复 4 次,取平均值[6]。

2.5溶出量 取醋延胡索饮片,加水回流提取,分别于10,20,40,60,90和120 min取适量提取液,运用UPLC色谱分析方法进行延胡索乙素等药效成分的检测,计算各时间点的溶出度。

2.5.1色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),乙腈(B)-0.2%甲酸(A)溶液,流速0.3 mL·min-1,柱温55 ℃,检测波长280 nm,进样量 1 μL;梯度洗脱 0～10 min,12%→14%B;10～14 min,14%→25%B;14～17 min,25%→40%B;17～20 min,40%→45%B;20～21 min,45%～12% B。见图1。

1.四氢非洲防己碱;2.原阿片碱;3.四氢黄连碱;4.非洲防己碱;5.延胡索乙素;6.盐酸小檗碱;7.盐酸巴马汀;8.去氢紫堇碱。

2.5.2对照品溶液的制备 精密称定四氢非洲防己碱、原阿片碱、四氢黄连碱、非洲防己碱、延胡索乙素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、去氢紫堇碱,分别置10 mL量瓶,加甲醇溶解定容至刻度,得到浓度分别为 988,1002,990,988,1004,990,996和1000 μg·mL-1对照品溶液。量取上述四氢非洲防己碱对照品溶液 0.5 mL,原阿片碱对照品溶液 0.2 mL,四氢黄连碱对照品溶液1.5 mL,非洲防己碱对照品溶液0.1 mL,延胡索乙素对照品溶液0.5 mL,盐酸小檗碱对照品溶液0.1 mL,盐酸巴马汀对照品溶液0.2 mL,去氢紫堇碱对照品溶液0.5 mL,加甲醇定容至10 mL量瓶,配成上述对照品浓度分别为 49.4,20.0,148.5,9.9,50.2,9.9,19.9和50.0 μg·mL-1混合对照品溶液。

2.5.3方法学考察 本课题组前期建立了检测方法的方法学[7]。四氢非洲防己碱、原阿片碱、四氢黄连碱、非洲防己碱、延胡索乙素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、去氢紫堇碱8种生物碱的精密度RSD分别为1.00%,1.92%,0.73%,1.66%,0.95%,1.75%,1.05%和0.80%;稳定性RSD分别为 1.85%,1.83%,1.86%,1.49%,1.60%,1.28%,1.38%和0.29%;重复性RSD 分别为1.52%,1.64%,1.05%,0.81%,1.66%,1.79%,1.94%和1.42%;加样回收率 RSD分别为1.79%,1.83%,1.12%,1.94%,1.22%,1.93%,0.97%和1.22%。结果均符合含量测定要求,表明精密度、重复性、稳定性、加样回收率良好。

3 实验结果

3.1复水率 由表 2 可知,复水率范围1.51～2.14 g·g-1,真空冷冻干燥>真空干燥>晒干>烘干。除晒干和真空干燥外,其余样品两两比较均差异有统计学意义(P<0.05),且大小个规律一致,复水率一定程度上可以反映药材的组织结构特性,这是因为真空冷冻干燥是将物料中的水分直接由冰晶状态升华成气体,保持了疏松多孔结构[4],复水性较好,与其他3种干燥方法比较,差异有统计学意义。烘干、真空干燥及晒干是由表及里的热传递方式,烘干由于长时间高温,导致组织收缩及塌陷严重,物料形成相对致密的结构,复水率最低。真空干燥由于高真空度,限制了空隙的收缩,复水率次于真空冷冻干燥。

3.2折干率 由表2可知,折干率范围在27.04%～34.30%,其中晒干>真空干燥>烘干>真空冷冻干燥。其中,烘干样品和真空干燥样品、大个晒干和真空干燥样品差异无统计学意义,其余大个样品和小个样品两两比较均差异有统计学意义(P<0.05)。折干率是衡量药材品质和确定采收期的重要指标,受自身因素和外界环境因素影响[5]。真空冷冻干燥由于疏松多孔的结构,质地较轻且含水量少,折干率显著小于其他3种干燥方法。

表2 不同干燥方法对醋制延胡索饮片复水率、折干率、硬度的影响

3.3硬度 由表2可知,硬度范围4.98～71.56N,烘干>晒干>真空干燥>真空冷冻干燥,4种干燥方法间两两比较均差异有统计学意义(P<0.05),且大小个规律一致,烘干和晒干导致醋制延胡索表面结构紧缩,硬度较大,真空干燥由于压力差,使负压状态中的水沸点降低,物料易形成微孔结构。真空冷冻干燥由于干燥后蓬松多孔结构所以硬度最小。

3.4成分溶出量 结果见图2。四氢非洲防己碱、原阿片碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、盐酸巴马汀、去氢紫堇碱在 0～20 min 真空冷冻干燥总溶出量和溶出速率高于烘干、晒干及真空干燥。非洲防己碱、盐酸小檗碱在 0～10 min真空冷冻干燥溶出速率高于其他干燥方式。真空冷冻干燥后,药材疏松多孔,溶液易于浸润,成分溶出快。真空冷冻干燥样品中,药效指标性成分延胡索乙素在 10,20 min溶出量分别占总溶出量的54%～57%,79%～81%;其他3种干燥方法分别占总溶出量的 24%～29%,51%～55%。烘干法和晒干法表面紧缩,质地紧密,成分相对溶出慢。

8种成分总溶出量在40,60,90,120 min时大小顺序均为烘干>真空干燥>晒干>真空冷冻干燥,且大小个趋势一致。这可能是烘干法干燥速率快,对成分影响小,因此烘干样品中成分总含量较高。以120 min最终溶出量为例,非洲防己碱和去氢紫堇碱为真空干燥样品含量最高,但与烘干样品差异无统计学意义。四氢非洲防己碱、原阿片碱、盐酸巴马汀为晒干样品中含量最高。其中,四氢非洲防己碱、盐酸巴马汀含量与烘干样品中含量差异有统计学意义(P<0.05)。四氢黄连碱、延胡索乙素、盐酸小檗碱为烘干样品含量最高,且与其他样品差异有统计学意义。表明烘干处理的醋延胡索饮片,适于提取其有效成分或有效部位,加水回流提取120 min获得最大提取率。见图3。

1.四氢非洲防己碱;2.原阿片碱;3.四氢黄连碱;4.非洲防己碱;5.延胡索乙素;6.盐酸小檗碱;7.盐酸巴马汀;8.去氢紫堇碱。

考虑临床中药煎煮时间一般为 20～30 min,选取醋延胡索饮片,加水回流提取20 min时各成分溶出量和外观特征指标进行化学计量学评价,深入挖掘信息。

图3 不同干燥方法醋制延胡索样品120 min各成分溶出折线图

3.5聚类分析 运用SPSS 23.0版统计软件进行系统聚类分析。以8种成分含量、复水率、折干率、硬度为指标,采用组间连接法和欧氏距离对数据进行分析,结果见图4。

图4 不同方法干燥的醋制延胡索样品聚类分析图

本次分析可分为两类:以真空冷冻干燥为一类,其余3种干燥方式为一类,大小个醋制延胡索规律一致,说明真空冷冻干燥方法醋制延胡索样品与其他3种干燥方式样品有显著差异。其余3种干燥方式能进一步区分,提示3种不同干燥方式对醋延胡索质量影响不同。通过测量外观特征指标和内部多组分含量,结合聚类分析,可以对醋延胡索质量做出客观评价,具有良好的识别能力。

3.6主成分分析 在聚类分析基础上,以8种成分含量、复水率、折干率、硬度为分析变量,采用SPSS 23.0版统计软件对数据进行主成分分析,结果表3、表4。

表3 主成分特征值和方差贡献率

表4 主成分分析载荷矩阵

如表3所示,第一主成分贡献率53.18%,第二主成分贡献率25.15%,前3个成分累计方差贡献率93.51%,能反映大部分信息,预测结果合理。主成分分析载荷矩阵见表4,主成分1主要反映四氢非洲防己碱、原阿片碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、盐酸巴马汀、去氢紫堇碱、复水率等指标信息,主成分2主要反映四氢黄连碱、非洲防己碱、延胡索乙素、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱信息。3个主成分均能反映延胡索乙素信息。利用SIMCA 14.0版软件进行无监督主成分,得到主成分得分图,见图5。主成分分析结果和聚类分析结果一致,样品被分为两类:冷冻干燥为一类,其余为一类,大小个规律一致。说明冷冻干燥效果与其他干燥明显不同。冷冻干燥醋制延胡索硬度小,外观特征良好,成分溶出快,便于临床煎煮。以药效指标性成分延胡索乙素含量为主,综合多组分含量和外观特征指标,结合聚类分析和主成分分析的评价方法可用于醋延胡索质量控制。

图5 主成分分析得分图

4 讨论

晒干法周期长,依赖自然条件,可控性差,外观易改变,适合小批量药材初干燥。烘干法以流动热风加热药材并带走水分,干燥设备成本低,效率高,温度可控,适用于大多数中药材的产地加工或干燥储藏。真空冷冻干燥可以较好地保持原料色泽和成分,但需较高的能耗和设备投资,干燥时间较长,不适合大规模生产。真空干燥可以提高热效率,适合热敏性物质的干燥加工,但存在运行成本高、设备投入大的问题,且干燥后中药内部结构松泡,外部水分易再次进入,不适合运输和长期贮藏。在生产或研究中应根据应用目的和中药特性选用合适的干燥方法[8-10]。

延胡索的主要有效成分为生物碱,其生物活性是多种组分共同作用的结果,因此单一延胡索乙素难以全面评价药材质量。但其他生物碱的药理药效研究较少,所占权重也尚不明确,所以多组分评价延胡索质量的标准需要进一步研究完善[11]。

中药溶出的速度与程度是中药质量及临床中药煎煮的重要影响因素,冷冻干燥醋延胡索饮片,在加水回流提取20 min 溶出速度和含量优于烘干、晒干以及真空干燥的醋延胡索饮片,制备饮片宜选用冷冻干燥。成药生产或者研究过程中,需获得成分最大含量,宜选用烘干样品长时间提取。笔者在实验中选用浙江产地延胡索,对不同干燥方式对醋制延胡索物性及溶出影响做了初步探究,干燥时间、温度等干燥工艺对干燥效果和延胡索质量的影响有待深入研究,为验证批次之间稳定性以及产地之间的差异性还需进一步实验考证。