具核梭杆菌与口腔鳞状细胞癌关系的研究进展

徐依萍,黄嘉玲,刘忠斌,杨 琨,葛 颂

口腔癌是全球最普遍的癌症之一,根据2020年统计,全球每年新发病例377 713例,死亡177 757例[1]。口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常见的口腔癌类型,占所有口腔癌的90%以上[2]。尽管OSCC的临床治疗取得了较大进展,但OSCC患者的预后仍然很差,5年生存率仅为40%～50%[3],这极大增加了全球公共卫生负担。

口腔黏膜暴露于大量微生物中,这些微生物组成了口腔微生物群,其中牙菌斑生物膜是口腔中主要的微生物生态群体。最近有报道称,龈下微生物群及其代谢副产物会改变上皮细胞遗传特性并促使其发生癌变[4]。具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)是牙菌斑生物膜发育和成熟的关键参与者,也是口腔感染部位的优势菌,当细菌群落中的平衡被破坏时,它便能促进炎症和抑制局部免疫反应[5]。不仅于此,Fn与OSCC之间同样存在关联性。越来越多的学者们发现Fn可通过增强肿瘤细胞增殖、侵袭迁移、耐药性等多种肿瘤生物学特性,促进OSCC的发生发展。本文就Fn与OSCC的相关性和潜在相关机制以及Fn在OSCC靶向治疗中的作用展开综述,以期为OSCC的防治提供新的理论基础。

1 Fn与OSCC的相关性

Fn是一种革兰氏阴性专性厌氧无芽孢杆菌,属于梭杆菌属,因其细长的形状和两端的纺锤状尖端而得名,是牙周炎主要致病菌之一[5]。随着研究的不断深入,学者们发现Fn不仅在OSCC组织中富集,而且能促进OSCC的发生发展。早在1998年,Nagy等[6]就观察了与OSCC相关的口腔细菌,其中就包括Fn。近年来,多项研究发现Fn在OSCC组织中相对丰度高于正常组织,并且是肿瘤组织中代表性最显著的物种[7-8]。Zhang等[9]使用16S rDNA测序发现了与OSCC相关的微生物群组成的变化,Fn、中间普氏菌(Prevotellaintermedia)、惰性凝集杆菌(Aggregatibactersegnis)、Capnocytophagaleadbetteri、口炎消化链球菌(Peptostreptococcusstomatis)等细菌与OSCC存在潜在关联,尤以Fn相关性最强;并运用PICRUSt技术预测分析微生物功能发现,促炎因子脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)生物合成的基因及与细胞运动(细菌趋化及鞭毛组装)相关的基因在OSCC组显著富集,它们本质上均具促炎作用,说明以Fn为代表的炎症性细菌组在介导促癌炎性环境中发挥重要作用。一项宏转录组分析显示,Fn是在OSCC肿瘤部位表达毒力因子最活跃的细菌,由此被认为可能是导致OSCC患者口腔微生物组中毒力因子表达增加的主要原因[10]。Yang等[11]进一步将微生物组的差异与癌症进展联系起来,发现OSCC进展期患者Fn丰度显著高于对照组(2.98%),其中Ⅳ期患者(7.92%)更为明显,说明Fn的丰度与恶化程度呈正相关。上述证据表明,Fn与OSCC发生发展关系密切,且对Fn的检测已被建议作为OSCC诊断标准之一[12]。

2 Fn影响OSCC的潜在机制

2.1 Fn促进OSCC细胞增殖

OSCC是一种上皮组织恶性肿瘤,Fn能通过导致细胞DNA损伤、增加原癌基因的表达来促进癌细胞增殖。

Fn可通过诱发细胞DNA损伤促进细胞增殖。Geng等[13]在体外用Fn感染Tca8113舌鳞癌细胞,发现在细胞感染Fn(MOI=500)后,DNA损伤分子标记物γ组蛋白H2A(γH2AX)表达增加,表明肿瘤发生了严重的DNA损伤,负调节细胞周期进展的p27下调,导致细胞周期加快,细胞增殖能力增强;同时,参与DNA双链断裂修复的Ku70和p53的表达被下调;研究者们还通过转染过表达Ku70,发现p53的上调抑制了细胞增殖能力,因此他们认为Fn通过Ku70/p53途径在OSCC细胞中引起DNA损伤并促进细胞增殖。此外,Fn可活化toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)并向髓样分化初级反应基因88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)发出信号来增加miR-205-5p的表达,抑制DNA错配修复(mismatch repair,MMR)相关基因的表达,促进DNA损伤及OSCC细胞增殖[14]。Fn还可通过TLR4/MyD88增加miR21的表达,从而激活NF-κB及其下游促炎性细胞因子的表达和释放,增强结直肠癌(colorectal cancer,CRC)上皮细胞增殖、迁移能力,促进CRC的发生发展[15]。已有研究表明,CRC中的Fn菌株与从口腔中分离的该物种的菌株相同,这表明肿瘤内Fn可能起源于口腔[16]。因此,我们推测这也是Fn影响OSCC细胞增殖的机制之一。

Fn上调原癌基因的表达亦可促进细胞增殖。STAT3、JAK1和MYC是三种原癌基因,对癌细胞具有抗凋亡和促增殖作用。体外实验证明,在Fn体外感染OSCC细胞中,以上三种癌基因表达均上调;另一方面,体内实验表明,感染Fn的OSCC小鼠舌组织切片中癌细胞增生明显,核质比增加[17],表明Fn有助于OSCC存活并增强其增殖能力。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)也是一种重要的原癌基因,在通过G1至S期进展的细胞周期调节中起重要作用,其过表达会导致细胞周期失调,促进细胞快速增长[18];此外,Cyclin D1还与OSCC低分化程度、淋巴结转移呈显著正相关[19]。Fn的FadA黏附素通过E-钙黏蛋白(E-cadherin)上调膜联蛋白A1(Annexin A1)表达激活Wnt/β-catenin信号传导,使Cyclin D1等癌基因过表达,可导致癌细胞增殖[20]。

2.2 Fn促进OSCC侵袭迁移

Fn可通过引发口腔上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和促进炎症因子分泌进而促进OSCC侵袭转移。

EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下转化为间充质细胞的现象[21]。细胞通过此过程可能失去连接和极性,从而获得侵袭和转移能力[22]。ZEB家族和SNAI1的转录因子在上皮细胞EMT中起着关键作用,其直接与E-cadherin基因的启动子结合并抑制其表达[23]。值得一提的是,E-cadherin是一种肿瘤抑制剂,负向调控细胞迁移,现已证实Fn可直接通过下调E-cadherin表达促进OSCC细胞迁移[24]。Harrandah等[17]发现Fn感染OSCC细胞能显著诱导EMT标志物ZEB1和转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)表达增加;与未感染的对照组相比,感染Fn的小鼠舌部肿物病变更重。长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)也是EMT的重要调节剂[25]。张树伟等[26]研究发现Fn感染导致lncRNA MIR4435-2HG的上调,降低其特异性microRNA-296-5p的表达,从而导致其靶基因Akt2表达增加,进而激活了SNAI1转录因子的表达,最终促进口腔上皮细胞发生EMT改变。最新研究发现,Fn还通过上调OSCC细胞中部分EMT(partial-epithelial mesenchymal transition,p-EMT)相关基因来增强其侵袭能力[27],且p-EMT较完全EMT会带来更高的转移风险[28]。

此外,Fn还可通过促进炎症因子分泌进而促进OSCC侵袭转移。一方面,Fn可感染牙龈上皮细胞(gingival epithelial cells,GECs)导致NF-κB的早期激活,上调前白介素1β(pro-interleukin-1β,pro-IL-1β)基因表达,激活NLRP3炎症小体,诱导活化半胱天冬酶1(caspase1),caspase1的活化可将pro-IL-1β切割成成熟的致炎因子IL-1β[29];另一方面,IL-1β的过表达使肿瘤细胞分泌致癌细胞因子IL-6、IL-8和生长调节癌基因α(growth-regulated oncogene-α,GRO-α),促进血管生成并增加OSCC细胞的侵袭及转移,导致晚期OSCC患者不良预后[30]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)也是促肿瘤侵袭转移的重要因素之一。研究表明,Fn及其细菌培养上清液均能上调OSCC细胞中MMP-1、MMP-9及IL-8的表达,并增强其侵袭性,这一发现还说明Fn可分泌某些活性物质,使Fn不与肿瘤细胞直接接触即可发挥致癌作用[17]。Uitto等[31]发现Fn可刺激上皮细胞中p38 MAPK活性,进而上调MMP-13 mRNA的表达,促进MMP-13的分泌,从而促进上皮细胞迁移。这一研究结果与Johansson等研究结果[32]相符,他们发现MMP-13在肿瘤细胞中高表达并增强OSCC侵袭转移能力。

2.3 Fn增强OSCC耐药性

化疗药物可缩小肿瘤大小,从而促进放疗可行性并减小手术所造成的颌面部破坏范围[33]。顺铂因其有效的抗癌作用及低成本的优势,被用作抗肿瘤一线治疗药物。它通过产生不可修复的DNA损伤来诱导细胞衰老或触发内在的凋亡机制,从而杀死肿瘤细胞[34]。但越来越多研究证明,Fn感染会导致OSCC对化疗药物的耐药性。

Fn可通过调控相关信号通路增强OSCC耐药性。研究发现,Fn的LPS可通过TLR4/MyD88激活OSCC细胞中p38 MAPK和NF-κB信号通路并刺激IL-6、IL-8和血管内皮生长因子产生,这三种细胞因子均与促血管生成有关,进而可能导致OSCC对顺铂的耐药性[35];因此,抑制TLR4及其信号通路可能会提高对顺铂的敏感性,并有助于改善OSCC患者的预后。体外实验发现,用Fn预处理口腔舌鳞癌细胞系Cal-27和HSC-3细胞,与对照组未处理的癌细胞相比,各组加入顺铂后,Fn组癌细胞死亡率更低;这可能与Fn可上调Wnt5a的转录水平,激活Wnt/Ca2+通路,并通过活化T细胞核因子3(nuclear factors of activated T cells 3,NFATc3)下调凋亡相关蛋白p53表达有关。因此,Fn可能通过Wnt/NFAT通路促进OSCC细胞的顺铂耐药[24]。

Fn还可通过促进鳞状细胞癌中的细胞自噬产生化疗耐药性。一项临床队列研究发现,瘤内Fn水平较高的食管鳞癌(oesophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者对化疗抵抗力更大;通过体外Fn感染ESCC细胞研究进一步发现,Fn使化疗条件下的ESCC细胞生长速率加快、凋亡降低,细胞自噬标志物LC3的表达显著高于对照组且与FnDNA的量呈正相关[36]。头颈部鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是ESCC的第二多见原发癌、与ESCC之间存在密切相关性[37],而OSCC是HNSCC主要类型之一,且口腔与食管同属上消化道,致病环境相通。因此,我们推测细胞自噬导致的耐药机制在OSCC中同样存在;同时,这也提示自噬标志物及FnDNA表达水平可能成为疾病进展及预后的临床标志物[36]。

3 以Fn为靶点的OSCC治疗策略

3.1 抗生素治疗

甲硝唑属于硝基咪唑类药物,是一种针对革兰氏阴性菌的强效抗菌药[38]。研究发现,以甲硝唑为代表的抗生素治疗可负向调节由Fn诱导的多种肿瘤进展。甲硝唑可降低结肠癌小鼠Fn负载、癌细胞增殖和肿瘤生长[39],预防乳腺癌小鼠肺转移[40],逆转Fn诱导的ESCC化疗药物耐药性[36]。为避免全身多剂量用药导致的耐药及菌群失调风险,OSCC患者可采用口腔局部用药的方式,如含漱或局部涂擦[41]。然而,目前仍缺乏抗生素通过降低Fn负载抑制OSCC发生发展的直接证据,因此,基于上述作用机制开展大规模多中心临床研究、深入挖掘靶标于Fn的抗生素对OSCC的治疗潜力是非常必要的。

3.2 益生菌辅助

近年来,大量研究证明了益生菌及其代谢产物对Fn的抑制作用。研究发现,活的和热灭活的益生菌对Fn均有较强的抑制作用,尤以活益生菌效果更佳,其具有作为抗菌和抗致瘤剂的治疗潜力[42]。乳酸菌代谢产物苯乳酸能改变Fn细胞膜的通透性使胞内蛋白外泄;并降低Fn黏附性,破坏生物膜结构,从而达到对Fn良好的抑菌作用[43]。Kamarajan等[44]研究发现细菌素乳酸链球菌素可逆转Fn通过TLR/MyD88所介导的OSCC迁移、侵袭及瘤体增大。然而,益生菌辅助疗法存在菌血症或败血症的风险,为保证其安全性,仍需进行长期的评估与研究[45]。

3.3 Fn致癌相关蛋白抑制剂

针对Fn致癌相关蛋白,包括Fn表面关键蛋白及肿瘤细胞表面受体TLR4的特异性靶向药物对OSCC具有较好的疗效。FomA是Fn表达最高的外膜蛋白之一,在Fn自聚集及入侵口腔上皮细胞等方面起到重要作用[46]。靶向FomA的疫苗可抑制Fn共聚、生物膜形成及入侵靶细胞[41]。研究证明,Fn表面蛋白Fap2可与人抑制受体TIGIT结合,抑制自然杀伤(natural killer,NK)细胞等免疫细胞毒性从而实现肿瘤细胞的免疫逃逸,靶向Fap2的疫苗可恢复NK细胞的杀伤能力[47]。这些药物理论上均可阻碍OSCC进展。同时,鉴于Fn促进OSCC进展需通过TLR4介导,研究发现在miR-195高表达的OSCC细胞中,TLR4蛋白表达降低,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡明显增强,从而发挥抗肿瘤作用[48]。但TLR4对维持机体正常生理活动起到重要作用,因此其不良反应也有待深入研究。

3.4 噬菌体疗法

由于细菌生物膜对常规抗菌疗法具有高度耐药性,对口腔生物膜进行生物控制的创新方案层出不穷,其中噬菌体疗法具有一定代表性[49]。噬菌体作为一种特异性感染的病毒,对细菌具有强杀伤力,可在活菌内自我增殖,并可渗透至口腔生物膜中[50]。已有研究证明噬菌体FNU1能破坏Fn生物膜,并能有效杀伤生物膜内细胞,它可被配制成糊剂涂抹至黏膜上,使噬菌体缓慢释放[51],对OSCC发挥靶向抗肿瘤作用。噬菌体还可与其他抗菌剂一起使用,以提高生物膜控制的有效性[52],但其最佳给药方式还需进一步研究。

4 小 结

Fn能够通过促进OSCC细胞增殖、增强肿瘤细胞侵袭转移能力、产生对化疗药物耐药性等机制促进OSCC的发生发展(图1)。其中TLR4/MyD88、NF-κB及p38MAPK等途径参与多个致癌过程,MMP及IL等炎性因子也在多条致病机制中起关键作用,因此,以Fn及其相关致病分子为靶点的靶向精准治疗可能成为OSCC防治或改善预后的新思路。目前以Fn为对象的治疗策略主要集中在抗生素、益生菌、Fn致癌相关蛋白抑制剂及噬菌体方面,但这些治疗方法的有效性缺乏临床应用证据,其开发与利用需更全面地考量。

图1 Fn增强肿瘤细胞增殖、侵袭转移及耐药性的分子机制Fig.1 Molecular mechanism of Fn enhancing proliferation, invasion, metastasis and drug resistance of OSCC cells

所有作者声明不存在利益冲突。