法尼醇对白念珠菌生物膜葡聚糖的影响及白念珠菌耐药相关性

张琴琴,马 鸣,花 荣,吕 盈,史般若,吴翘楚,魏 昕

白念珠菌是机体常见条件致病菌[1],生物膜是其主要致病状态。由于胞外基质的保护,生物膜状态的白念珠菌致病性和耐受性较浮游状态更强[2-3]。葡聚糖是白念珠菌细胞壁的主要成分,与生物膜的形成密切相关[4]。细胞壁和细胞外基质中的葡聚糖成分还能和抗真菌药物结合,以阻止药物到达深层细胞。因此,葡聚糖的改变可影响传统抗真菌药物对白念珠菌生物膜细胞的作用[5]。

法尼醇是一种重要的密度感应分子(quorum sensing molecular,QSM),当微生物种群密度增加引起细胞外环境中QSM的积累达到阈值浓度时,可以诱导或抑制微生物基因表达[3,6]。在白念珠菌中,法尼醇参与抑制菌丝及生物膜形成,并且一定浓度的法尼醇还可以抑制白念珠菌的生长,诱导其凋亡[7-8]。目前,关于法尼醇能否通过影响真菌细胞壁的葡聚糖来改变白念珠菌细胞壁的形态,并通过这种细胞壁形态的改变影响白念珠菌生物膜耐药性的相关研究罕见报道。

本实验拟探究法尼醇对白念珠菌生物膜形态、葡聚糖基因表达的影响及白念珠菌耐药相关性,以期为白念珠菌感染的治疗和真菌耐药机制的探索提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

白念珠菌标准株(SC5314)由上海第二军医大学药学院遗传工程国家重点实验室馈赠。沙堡琼脂培养基(Sabourd's dextroseagar,SDA)(63.0 g/L)(上 海樊客生物科技有限公司,中国),YPD培养液(2%葡萄糖、1%酵母提取物,BioFroxx,德国),2%胰蛋白胨(Oxoid,英国),PBS缓冲液(索莱宝,中国),RPMI 1640培养基(Gibco,美国),氟康唑、法尼醇(Sigma,美国),2.5%戊二醛(北京雷根生物技术有限公司,中国),KONT真菌显色MIC药敏系统(温州康泰生物科技有限公司,中国),逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司,中国),iTaq SYBR Green预混酶(BIO-RAD,美国),YCP系列二氧化碳培养箱(上海易亮医疗器械有限公司,中国),低温高速离心机(Eppendorf,德国),透射电镜(FEI公司,美国)。

1.2 白念珠菌菌悬液的配制

将-70 ℃保存的白念珠菌标准株SC5314接种到SDA培养基上,37 ℃、5% CO2培养24 h后,取单克隆菌株于YPD培养基中,30 ℃、180 r/min摇床过夜。2 100 ×g离心10 min,收集YPD培养液中的细胞,无菌PBS洗涤2次,细胞重悬于RPMI 1640培养液中,血细胞计数法制备成浓度为5×105CFU/mL的标准菌悬液。

1.3 氟康唑诱导耐药株形成

根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)CLSI M27-A3文件,检测氟康唑对白念珠菌标准株SC5314的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

在96孔培养板中加入100 μL氟康唑溶液(浓度依次为128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/mL),再加入100 μL用RPMI 1640稀释的白念珠菌菌悬液(稀释后为2.5×103CFU/mL),空白组加入100 μL去离子水和100 μL白念珠菌菌悬液。将96孔板放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后读取结果。MIC为抑菌数量达80%的实验组所用的最低药物浓度。

随后,按照上面获得的白念珠菌标准株SC5314的MIC值诱导氟康唑耐药株。根据CLSI M27-A3 氟康唑耐药株的判断标准,MIC≥ 64 μg/mL为耐药菌株。本实验选用MIC≥128 μg/mL的菌株为耐药株。将-70 ℃保种的白念株菌标准株SC5314接种到SDA培养基上,37 ℃、5% CO2培养24 h,挑取单克隆菌株于5 mL RPMI 1640中(含2×MIC药物浓度的氟康唑),30 ℃、180 r/min摇床生长24 h,取100 μL菌悬液涂布于SDA培养基上(含4×MIC药物浓度的氟康唑),37 ℃、5% CO2培养48 h。用KONT真菌显色MIC药敏系统检测上述在含药物SDA培养基诱导培养后白念珠菌的MIC。如果此次检测所得MIC值<128 μg/mL,则重复上述步骤,直至MIC≥128 μg/mL。将取得的耐药株菌悬液加入等体积30%甘油,-70 ℃保种。诱导成功的耐药株在不含药物的SDA培养基上每传2代测1次MIC,以判断其稳定性。按照1.2的方法制备浓度为5×105CFU/mL的耐药株菌悬液待用。

1.4 白念珠菌生物膜的构建及法尼醇干预

将白念珠菌分为对照组、法尼醇处理组和耐药株组,制备各组菌悬液并调整浓度为5×105CFU/mL,对照组及法尼醇处理组加入白念珠菌标准株SC5314菌悬液,耐药株组加入耐药株菌悬液,分别加入6孔板中。37 ℃、5% CO2孵育1 h后,移除培养液,无菌PBS轻洗3次以去除未黏附的细胞,加入RPMI 1640培养液。法尼醇处理组中加入法尼醇(浓度为100 μmol/L),对照组和耐药株组中加入等体积的去离子水。在37 ℃、5% CO2条件下继续培养至6、12、24、36 h。

1.5 透射电镜观察生物膜

将上述3组6、12、24、36 h生物膜用无菌刮刀剥离,收集于1.5 mL EP管中,2 100×g离心10 min,弃上清液。加入2.5%戊二醛1 mL,4 ℃固定6 h,送电镜室脱水,包埋,切片,观察。白念珠菌生物膜成熟大约需要24 h,因此本实验选择24 h这一具有代表性时相的生物膜,分析细胞壁电子颗粒层和厚度。

1.6 白念珠菌总RNA提取

分组同1.4。选用50 mL的培养瓶作为生物膜构建的载体,将6 mL浓度为5×105CFU/mL菌悬液加入培养瓶中,37 ℃、5% CO2孵育1 h,此时在培养瓶底壁部形成白念珠菌早期生物膜。移出培养液,无菌PBS缓慢冲洗培养瓶3次,加入6 mL RPMI 1640培养液。法尼醇处理组中加入法尼醇(浓度为100 μmol/L),对照组和耐药株组中加入等体积的去离子水,37 ℃、5% CO2培养24 h。用无菌细胞刮刀刮取上述3组的24 h白念珠菌生物膜,并收集于15 mL离心管中,2 100×g离心10 min。弃上清液,每管加入400 μL TES和400 μL水饱和酚,剧烈振荡混匀,63 ℃水浴1 h,其间每隔10 min剧烈振荡1次。随后,4 ℃冰浴5 min,12 000 r/min离心15 min。上层水相移至1.5 mL EP管中,加入400 μL水饱和酚剧烈振摇混匀,4 ℃、12 000 r/min离心15 min后将上层水相移至1.5 mL EP管中,加入400 μL氯仿剧烈振摇混匀,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,再将上层水相移至1.5 mL EP管中,加入40 μL的醋酸钠(NaAc 3 mol/L,pH 5.2)及1 mL无水乙醇,-20 ℃静置30 min。4 ℃、12 000 r/min离心15 min,弃上清液,加入700 μL 75%乙醇,8 000 r/min 离心5 min。弃上清液,室温干燥后,加入30 μL DEPC水溶解,提取获得RNA用于qPCR检测。

1.7 qPCR检测葡聚糖相关基因表达

葡聚糖相关基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司根据genebank白念珠菌SC5314基因序列设计并合成(表1),18S rRNA为内参。使用前引物用无菌双蒸水稀释至20 μmol/L,参照逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒说明书,将反应物放在基因扩增仪内反应。逆转录结束后,采用iTaq SYBR Green预混酶进行反应,反应体系:10.0 μL iTaq SYBR Green预混酶,20 μmol/L的上下游引物各0.4 μL,10倍稀释的cDNA 1.0 μL,灭菌蒸馏水8.2 μL,反应总体积20 μL。加好样本的孔板放在ABI 7300 FAST型荧光定量PCR仪中进行反应,设置荧光定量PCR循环条件:95 ℃,2 min;95 ℃,10 s,循环40次;60 ℃,30 s;72 ℃,20 s;最后4 ℃冷却。采用 2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

表1 qPCR引物Tab.1 qPCR primer

1.8 统计学分析

使用SPSS 17.0软件对对照组和耐药组、对照组和法尼醇处理组的细胞壁厚度和qPCR结果分别进行独立样本t检验,P<0.05表示有显著性差异。

2 结 果

2.1 氟康唑耐药株模型构建成功

氟康唑对白念珠菌标准株SC5314的MIC为0.5 μg/mL(图1A)。经KONT真菌显色MIC药敏系统稳定性检测显示,当诱导株的MIC≥128 μg/mL时,表示氟康唑耐药菌株构建完成(图1B),每传2代进行菌株MIC的鉴定。

A:白念珠菌标准株SC5314,MIC值为0.5 μg/mL;B:氟康唑诱导耐药株,MIC≥128 μg/mL

2.2 透射电镜观察白念珠菌生物膜

透射电镜结果见图2。白念珠菌标准株SC5314的6、12、24、36 h生物膜的细胞壁、细胞膜及其他细胞器结构完整,未见明显异常。法尼醇处理后,各时相生物膜出现细胞壁厚度不均匀、细胞壁溶解、细胞壁膜分离、波浪状的细胞壁及细胞器形态改变等,法尼醇对各时相生物膜的抑制作用。在耐药株组,可以观察到各时相的细胞壁厚度有所增加,同时结构完整,细胞器形态正常。

A～D:对照组;E～H:法尼醇处理组;I～L:耐药株组

选取24 h白念珠菌生物膜,在200 000倍透射电镜下观察法尼醇干预后白念珠菌生物膜细胞壁结构变化(图3)。对照组中白念珠菌生物膜的细胞壁内、外层分别是低密度电子层和高密度电子层,同时存在很多散在的电子颗粒,厚度约为(220.10±2.25)nm。与对照组相比,法尼醇处理组中白念珠菌生物膜细胞壁中电子颗粒减少,细胞壁的厚度((145.90±4.05)nm)也明显更薄(P<0.05);耐药株组白念珠菌生物膜细胞壁中电子颗粒增多,并且细胞壁的厚度((299.47±3.33)nm)也有所增加,存在统计学差异(P<0.05)。

A:对照组;B:法尼醇处理组;C:耐药株组

2.3 葡聚糖相关基因表达

葡聚糖相关基因qPCR结果见图4。与对照组相比,法尼醇处理组PIR1表达上调(P<0.01),PHR2表达上调(P<0.05),GSC1表达下调(P<0.05),BGL2表达差异无统计学意义(P>0.05);耐药株组PHR2表达下调(P<0.05),GSC1表达上调(P<0.01),PIR1和BGL2表达差异无统计学意义(P>0.05)。

与对照组相比,*:P<0.05,**:P<0.01

3 讨 论

由于广谱抗生素和皮质类固醇滥用、侵入性医疗程序增加等,白念珠菌感染患者数不断上升且耐药株开始出现[9-11]。生物膜状态下的白念珠菌被细胞外基质覆盖保护,能够有效对抗药物杀菌作用,维持微生物的毒性作用[2-3],耐药性较浮游状态大大增加[12],是目前临床治疗白念珠菌感染的难题。因此本实验选用生物膜状态下的白念珠菌作为研究对象。氟康唑是临床上治疗白念珠菌感染的一线药物,临床分离的耐药株中常见氟康唑耐药株,故本实验选用氟康唑诱导构建白念珠菌耐药模型,探索其耐药的机制。

葡聚糖作为白念珠菌细胞壁的主要成分,与念珠菌耐药密切相关。有研究表明,当静止相白念珠菌生长相关葡聚糖增多时,白念珠菌对两性霉素B的易感性减弱[13]。葡聚糖酶处理后,可明显增强氟康唑和两性霉素B对生物膜的抑制作用[5,14-15]。念珠菌细胞壁的低密度电子层和电子颗粒主要是葡聚糖和壳多糖[16]。葡聚糖起初为颗粒状,继而形成细纤维,随后分出许多细丝形成纤维结构,接着大量β-葡聚糖分子聚集,形成念珠菌细胞壁的纤维网络结构[17]。本实验通过透射电镜观察24 h的白念珠菌生物膜,发现耐药株较白念珠菌标准株细胞壁厚度增加,电子颗粒增多,增多的电子颗粒可能是初期的葡聚糖颗粒。葡聚糖含量的改变导致细胞壁厚度的改变。此外,葡聚糖可以与抗真菌药物结合,随着结合的药物增多,外来的药物就不能到达深层的细胞。这表明耐药株组的细胞壁厚度和葡聚糖含量增加可能与其耐药性相关。

法尼醇由念珠菌分泌,能抑制白念珠菌酵母相向菌丝相的转变,进而抑制生物膜的形成[6,18]。本实验观察到在100 μmol/L的法尼醇作用下,白念珠菌细胞壁变形,厚度变薄,同时电子颗粒减少,表明细胞壁中葡聚糖含量减少。法尼醇可能通过降低细胞壁的厚度及细胞壁中葡聚糖的含量来增加抗真菌药物的易感性。

本实验采用qPCR检测葡聚糖相关基因PIR1、PHR2、BGL2和GSC1的表达。PIR1基因编码的Pir1p是β-1,3葡聚糖连接的细胞壁结构蛋白,当念珠菌从酵母相向菌丝相转变时,PIR1的表达下降[19]。单臂敲除PIR1基因后,缺陷菌株生长缓慢、形态异常,细胞之间抱团成簇,并且表现出对刚果红和卡尔科弗卢尔荧光染色剂的高度敏感性,表明PIR1基因在念珠菌形态转变和维持细胞壁结构完整性上起重要作用[4]。本实验中,法尼醇处理后,PIR1表达上调,推测原因可能是法尼醇处理后酵母相细胞增多所致。PHR2基因编码β-1,6葡聚糖所需的糖苷酶,其主要作用在白念珠菌细胞壁上β-1,6-葡聚糖的连接处,可水解葡聚糖,同时也可直接作为pH感应受体起作用。在酸性环境下,PHR2基因表达,抑制白念珠菌由酵母相向菌丝相转变[20-21]。本实验中,PHR2在法尼醇处理组表达上调,细胞中糖苷酶含量升高,进而促进葡聚糖分解。法尼醇作用后使原本在酸性环境中高表达的PHR2基因在碱性培养基中表达也出现了上调,抑制了白念珠菌形态的转换。相反,在耐药株组中,PHR2基因表达下调,细胞中糖苷酶含量下降,葡聚糖的降解减少,菌丝相白念珠菌增加,有利于生物膜的形成,葡聚糖含量增多增加了白念珠菌生物膜细胞的耐药性。GSC1基因编码β-1,3葡聚糖酶催化亚基[22],当敲除该基因后,会造成葡聚糖合成酶活性减弱以及葡聚糖合成量降低,导致细胞壁完整性的破坏。本实验中法尼醇组GSC1的表达降低,造成β-1,3葡聚糖含量减少,细胞壁的形态和结构改变;而耐药株高表达GSC1基因,通过促进葡聚糖的合成,增加白念珠菌生物膜的耐药性。BGL2基因表达的蛋白Bgl2p属于白念珠菌细胞壁葡萄糖基转移酶,其主要参与催化β-1,3-葡聚糖末端二糖的合成过程[4]。BGL2基因的表达在对照组、法尼醇处理组和耐药组间没有明显差异,推测BGL2基因与白念珠菌的耐药不相关,也不是法尼醇作用的机制之一。

本研究结果表明,法尼醇可以在一定程度上改变葡聚糖相关基因的表达,进而影响细胞壁的结构和成分,而细胞壁的结构变化与白念珠菌耐药性相关。