低氧经miR-130a-3p靶向Sirt7对人滋养细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化的影响

杨春芬,钟黎黎,盛 莹

子痫前期(preeclampsia,PE)是发生在妊娠20周后的特发性疾病,伴随高血压、蛋白尿、恶心等症状,是导致孕产妇妊娠期及围生儿死亡的主要因素[1]。目前,PE病因和发病机制尚不清楚。有研究[2]表明,在妊娠早期胎盘组织形成初始阶段,持续低氧会致使滋养细胞凋亡、侵袭能力降低,导致胎盘血管及器官发育异常,可能是PE病发的主要因素。miRNA是一类真核生物内源性、具有调控功能的小分子非编码单链RNA,参与不同生物过程的调节,包括发育模式、细胞分化、细胞增殖等过程。miR-130a-3p作为miRNA的一员,在细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化(mesenchymal transformation,EMT)等过程中起重要作用。例如,Chen et al[3]研究表明,上调miR-130a-3p抑制乳腺癌细胞活性、迁移、侵袭和EMT进展。Yang et al[4]研究表明,miR-130a-3p在PE患者胎盘组织中高表达,但具体功能和作用机制不详。去乙酰化酶(sirtuin-7,Sitr7)在机体中发挥多种调控作用,如细胞衰老、应激、肿瘤发生等。有研究[5]表明,Sitr7能够保护H9C2心肌细胞和原代心肌细胞免受低氧诱导的损伤和细胞凋亡。但Sitr7在滋养层细胞中表达情况以及miR-130a-3p是否可靶向Sitr7调控PE发展进程,目前还尚未见报道。因此,该研究旨在探讨低氧条件下经miR-130a-3p靶向Sirt7对人滋养细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化的影响及其作用机制,为PE的治疗提供新的靶点及理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo(美国ATCC公司);RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Sigma公司);Sirt7抑制剂97491(美国Selleck公司);Transwell小室(美国Corning公司);Matrigel基质胶(美国BD公司);miR-130a-3p mimics及其阴性对照mimics-NC、miR-130a-3p inhibitor及其阴性对照inhibitor-NC(广州锐博生物技术有限公司);Lipofectamine 2000试剂盒(美国Introvigen公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);Sirt7抗体、HIF-1α抗体、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体、MMP-9抗体、E-cadherin抗体、N-cadherin 抗体、Vimentin抗体、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶(HPR)偶联的二抗(北京博奥森生物技术有限公司);FQD-16A荧光定量PCR仪(杭州博日科技股份有限公司);Tanon-5200化学发光成像系统(上海天能科技有限公司);XD-202倒置生物显微镜(南京江南永新光学有限公司)。

1.2 细胞培养HTR-8/SVneo细胞采用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养,每2 d传代1次。

1.3 细胞转染取对数期HTR-8/SVneo细胞,调整细胞密度以2×105个/孔接种于6孔板中过夜,待细胞密度达70%时,使用Lipofectamine 2000将miR-130a-3p inhibitor及其阴性对照inhibitor-NC转染至HTR-8/SVneo细胞中,将细胞依次分为miR-130a-3p inhibitor组和inhibitor-NC组,另设置空白对照组(blank),置于培养箱培养48 h后,采用qRT-PCR检测转染效率。

1.4 细胞处理及分组第1部分实验:探讨低氧诱导过程中HTR-8/SVneo细胞中miR-130a-3p和Sirt7表达水平,即将HTR-8/SVneo细胞分为常氧组和低氧组,其中常氧组细胞采用常氧培养条件(21%O2+5%CO2+74%N2)分别培养12、24、48 h;而低氧组细胞采用低氧条件(1%O2+5%CO2+94%N2)分别培养12、24、48 h。第2部分实验:探讨抑制miR-130a-3p表达对低氧条件HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭及EMT的影响及机制,根据实验需要作如下分组,对照组(Con组):未经转染的HTR-8/SVneo细胞在常氧条件下培养48 h;低氧组(Hyp组):未经转染的HTR-8/SVneo细胞在低氧条件下培养48 h;低氧+inhibitor NC组(Hyp+ inhibitor NC组):转染inhibitor NC的HTR-8/SVneo细胞在低氧条件下培养48 h;低氧+miR-130a-3p inhibitor组(Hyp+inhibitor组):转染miR-130a-3p inhibitor的HTR-8/SVneo细胞在低氧条件下培养48 h;低氧+miR-130a-3p inhibitor+Sirt7抑制剂97491组(Hyp+inhibitor +97491组):转染miR-130a-3p inhibitor的HTR-8/SVneo细胞采用10 μmol/L Sirt7抑制剂97491预处理2 h,再在低氧条件下培养48 h。

1.5 Transwell检测细胞迁移及侵袭能力取对数期HTR-8/SVneo细胞,细胞密度为2×105个/孔接种于6孔板中,待细胞密度达70%时进行分组处理。收集各组细胞,使用无血清培养基调整细胞浓度至2×105个/ml,上室加入200 μl细胞悬液,下室加入600 μl 含10%胎牛血清的完全培养基,培养24 h后,取出小室,经固定、染色、水洗、晾干处理,使用显微镜拍照并记录迁移细胞数目。细胞侵袭:提前在小室中加入50 μl基质胶(1 mg/ml)置于培养箱中温育4 h,其他步骤同迁移实验。

1.6 qRT-PCR检测细胞中miR-130a-3p和Sirt7 mRNA表达水平分组处理后收集各组细胞沉淀,使用总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA。采用反转录试剂盒反转录总RNA为cDNA,并以此为模板进行PCR扩增反应。PCR条件为94 ℃预变性30 s,94 ℃变性30 s, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸45 s,扩增35个循环后,72 ℃终末延伸10 min。以U6或GAPDH为内参,采用2-△△Ct法计算miR-130a-3p与Sirt7相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot实验取对数期HTR-8/SVneo细胞,调整细胞密度以2×105个/孔接种于6孔板中,过夜,按1.4项下第2部分实验分组处理后收集各组细胞沉淀,加入RIPA裂解液充分裂解,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白含量。取40 μg蛋白经金属浴煮沸10 min变性,经电泳、转膜及封闭处理后,加入Sirt7抗体(1 ∶1 000)、HIF-1α抗体(1 ∶1 000)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体(1 ∶1 000)、MMP-9抗体(1 ∶1 000)、E-cadherin抗体(1 ∶1 000)、N-cadherin抗体(1 ∶1 000)、Vimentin抗体(1 ∶1 000)、GAPDH抗体(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育过夜。洗膜3次后,加入辣根过氧化物酶(HPR)偶联的二抗(1 ∶10 000)在室温下孵育1 h,洗膜3次,滴加ECL显影液。使用Image J软件分析待测蛋白的相对GAPDH的表达水平。

1.8 双荧光素酶实验验证miR-130a-3p与Sirt7靶标关系采用在线miRNA靶基因预测网站TargetScan Human 7.1预测miR-130a-3p与Sirt7 基因3′-UTR区域结合位点。设计合成Sirt7野生型(Sirt7-WT)和Sirt7突变型(Sirt7-Mut)荧光素酶表达载体,合成相应荧光素酶载体质粒,使用Lipofectamine 2000将Sirt7-WT、Sirt7-Mut分别与miR-130a-3p mimics、mimics-NC转染至HTR-8/SVneo细胞中,转染后检测相应荧光素酶活性,即萤火虫荧光素酶的检测值与海肾荧光素酶检测值的比值(Firefly Luciferase/Renilla Luciferase)。

2 结果

2.1 低氧对HTR-8/SVneo细胞中miR-130a-3p和Sirt7表达水平影响qRT-PCR实验结果(图1A)显示,与常氧组比较,低氧12、24、48 h后低氧组细胞中miR-130a-3p表达水平逐渐升高(F=46.295,P<0.001),而Sirt7 mRNA表达水平逐渐降低(F=75.993,P<0.001)。Western blot结果(图1B)显示,与常氧组比较,低氧12、24、48 h后低氧组细胞中Sirt7蛋白表达水平逐渐降低(F=18.152,P<0.001)。

图1 各组细胞中miR-130a-3p、Sirt7表达水平

2.2 抑制miR-130a-3p表达对低氧条件下HTR-8/SVneo细胞中miR-130a-3p和Sirt7表达水平影响qRT-PCR结果显示,与blank组比较,miR-130a-3p inhibitor组细胞中miR-130a-3p表达水平降低(P<0.05),而inhibitor-NC组无变化(P>0.05),提示miR-130a-3p过表达的HTR-8/SVneo细胞构建成功,见图2A。与Con组比较,Hyp组miR-130a-3p水平升高(P<0.05),Sirt7 mRNA水平降低;与Hyp+inhibitor NC组比较,Hyp+inhibitor组miR-130a-3p水平降低(P<0.05),Sirt7 mRNA水平升高;与Hyp+inhibitor组比较,Hyp+inhibitor+97491组miR-130a-3p水平无变化(P>0.05),Sirt7 mRNA水平降低(P<0.05),见图2B。

图2 各组细胞中miR-130a-3p和Sirt7表达水平

2.3 抑制miR-130a-3p表达对低氧条件下HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的影响Transwell结果(图3)所示,与Con组比较,Hyp组细胞迁移及侵袭数目减少(P<0.05);与Hyp+inhibitor NC组比较,Hyp+inhibitor组细胞迁移及侵袭数目增加(P<0.05);与Hyp+inhibitor组比较,Hyp+inhibitor+97491组细胞迁移及侵袭数目减少(P<0.05)。

图3 抑制miR-130a-3p表达对低氧条件下HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的影响 ×200

2.4 抑制miR-130a-3p表达对低氧条件下HTR-8/SVneo细胞中Sirt7、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的影响Western blot结果(图4)显示,与Con组比较,Hyp组Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05);与Hyp+inhibitor NC组比较,Hyp+inhibitor组Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平升高(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05);与Hyp+inhibitor组比较,Hyp+inhibitor+97491组Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)。

图4 各组细胞中Sirt7、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平

2.5 miR-130a-3p靶向Sirt7调控关系验证在线miRNA靶基因预测网站TargetScan Human 7.1数据库预测结果(图5A)显示,Sirt7的3′-UTR中存在与miR-130a-3p互补序列。双荧光素酶报告结果(图5B)显示,与mimics-NC组比较,miR-130a-3p mimics组与Sirt7-WT组共转染后可以降低其荧光素酶活性[(1.03±0.01)vs(0.24±0.03),P<0.05],而与Sirt7-Mut共转染后对其荧光素酶活性无影响[(1.02±0.01)vs(1.01±0.01),P>0.05]。

图5 miR-130a-3p靶向Sirt7调控关系验证

3 讨论

滋养层细胞维持正常的生理功能是胎盘正常发育和孕妇正常妊娠的前提。在妊娠早期,胎盘形成初始阶段处于相对低氧的环境,这种环境可以促进滋养细胞侵袭及血管形成;然而,持续低氧导致的低氧诱导因子(HIF-1α)的持续高表达会导致胎盘发育异常,诱发与妊娠相关疾病的发生,如PE和胎儿生长受限[6-7]。该研究结果显示,miR-130a-3p可靶向Sirt调控HIF-1α进而影响低氧条件下滋养层细胞HRT-8/SVneo迁移、侵袭及上皮-间质转化。

既往研究[8-9]表明,不同miRNA在正常妊娠和PE妊娠的胎盘组织中表达有所差异,同时这些 miRNA介导的滋养层功能揭示了PE的发病机制。miR-130a-3p是miR-130家族成员之一,其调控细胞增殖、迁移、侵袭等生物学功能已有研究揭示。例如在癌症研究[10]中,miR-130a-3p在结直肠癌组织中表达下调,可靶向WNT1抑制结直肠癌细胞增殖;然而,胃癌组织和细胞系中miR-130a-3p水平上调,可通过激活下游信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[11];此外,miR-130a-3p 在体外和体内均可抑制人食管鳞状细胞癌EC-1细胞的迁移、侵袭及上皮-间质转化[12]。目前,关于miR-130a-3p在PE中作用机制还尚未见报道。该研究表明miR-130a-3p在低氧诱导的人滋养层细胞HTR-8/SVneo中表达上调。实验结果显示,敲低miR-130a-3p表达可促进低氧条件下HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭,上调MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平,下调E-cadherin蛋白表达水平,说明敲低miR-130a-3p表达对PE有治疗作用。该研究结果显示敲低miR-130a-3p表达可上调Sirt7蛋白表达水平,下调HIF-1α蛋白表达水平。然而,miR-130a-3p与Sirt7的靶向关系以及Sirt7是否参与HIF-1α的调控仍需进一步研究。

Sirt7是sirtuin家族中一员,其作为一个关键的转录因子在多种癌症的发生发展过程中发挥重要的调节作用,如对于表观遗传学的调控、维持恶性肿瘤细胞的表型、调控肿瘤细胞的特异性生长、细胞侵袭以及细胞转移等肿瘤的生物学过程[13-14]。HIF-1α是具有转录活性的核蛋白,参与细胞增殖、分化、血管形成等多种生理进程。Hubbi et al[15]研究表明敲低Sirt7表达可上调HeLa、Hep3B、MDA-MB-231和293T细胞中HIF-1α蛋白表达水平。张展 等[16]研究表明,低氧可促进滋养细胞JEG-3中HIF-1α表达,沉默HIF-1α可抑制其侵袭和迁移能力。然而,Sirt7与HIF-1α在PE发展进程中的关系未知。该实验结果显示,Sirt7在低氧诱导的HTR-8/SVneo细胞中表达下调,其表达上调可降低HIF-1α水平,并促进低氧诱导的HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化。进一步研究表明,miR-130a-3p inhibitor联合Sirt7抑制剂干预后,可逆转miR-130a-3p低表达对低氧HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化的促进作用,并上调HIF-1α表达。此外,该研究通过双荧光素酶报告表明miR-130a-3p与Sirt7之间存在靶向调控关系,提示miR-130a-3p靶向Sirt7调控HIF-1α进而影响低氧条件下HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化。

综上所述,敲低miR-130a-3p表达可促进低氧条件下HTR-8/SVneo细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化,其机制可能与靶向调控Sirt7有关。该研究可为治疗PE提供新的思路,但仍需体内实验研究来进一步阐明miR-130a-3p在PE中作用的分子机制。