光照与核黄素浓度对核黄素光动力灭活病原体效果的研究

何缘圆,李彦玉,尹云弟,李 玲,陈可洋,刘 忠

输血是现代医学治疗中不可或缺的手段,但是输血感染仍然时有发生,感染性风险由可通过输血传播的病原微生物构成,其中包括人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等多种病毒以及大肠杆菌、金黄色葡萄菌、梅毒等细菌和原虫等。血液病原体灭活技术是最有希望能够进一步降低输血感染风险的方法,是保障血液安全的最后一道屏障,但血液病原体灭活技术目前还不成熟,还需要进一步研究和发展。

核黄素光化学病原体灭活法作为一种新型高效的病原体灭活技术近年来得到广泛的关注。核黄素一般是指维生素B2,是人体必需的营养物质。核黄素的安全性也已经得到了充分的肯定,它被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)归类为一般认为是安全的[1],并与紫外线介导的活化一起用于新生儿黄疸的治疗[2]。核黄素光化学法的原理是核黄素在受到紫外光或可见光激活,鸟苷碱基被氧化,通过电子转移对鸟嘌呤残基进行修饰,阻断核酸复制对核酸造成不可逆损伤[3-4],从而实现抑制或破坏病原体复制的目的。Mirasol PRT系统对临床相关病原体有效和灭活白细胞[5],而不显著损害产品的功效[6]或导致产品损失[7-8],同时也不需要后续的清除步骤。目前很少有文章报道血液病原体灭活研究中核黄素浓度与紫外光照联合作用效果,本文将探究不同光照时间与不同浓度核黄素对血浆水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)灭活效果的影响,为核黄素光化学法病原体灭活技术灭活条件的选择和灭活效果的优化提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂倒置光学显微镜购自日本尼康株式会社; ABO型血浆由四川德阳中心血站提供;核黄素购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;生理盐水购自四川科伦药业股份有限公司。

1.2 实验用病毒与细胞VSV(原代剂量15 ml由本所输血传播病原体研究中心馈赠);Vero E6(由本实验平台输血安全课题组传代保存)

1.3 实验方法

1.3.1核黄素浓度配制 取生理盐水配制终浓度为500 μmol/L的核黄素生理盐水溶液,溶液避光保存。

1.3.2病毒培养 取出VSV存管,水浴锅解冻。VSV复苏反复感染Vero E6细胞,连续传代,以增加病毒毒力;收集病毒培养液,离心过滤后,放入-80 ℃ 保存备用。使用前检测病毒原液滴度。

1.3.3病原体灭活 本实验旨在评估水疱性口炎病毒VSV在不同核黄素浓度和不同紫外光照时间下灭活效果。实验准备需要提前培养好细胞,实验当天取出同血型血浆,将血浆混合病毒液后再加入不同工作浓度核黄素配制好后加入血袋,配制为4组核黄素浓度,每组核黄素终浓度为50、100、150 μmol/L以及空白对照组;使用365 nm紫外线灯各组照射时间为10、15、20、25 min及未进行光照的对照组;每组设置重复实验6次。病毒灭活后,在灭活实验后使用终点滴定法(1 ∶10连续稀释,每个稀释8个平行样品)分析样品。Vero E6细胞与每个病毒样本一起培养,并在37 ℃和5% CO2下培养3～5 d。每天使用显微镜记录细胞病理学效应,并使用Reed-Muench法[9]计算病毒滴度。

2 结果

2.1 光照时间对灭活效果的影响当光照时间为10 min时,不添加核黄素组与添加核黄素组各组间差异有统计学意义(P<0.001),添加核黄素浓度50 μmol/L组与100 μmol/L组组间差异无统计学意义(P=0.633)(图1A);当光照时间为15 min时,不添加核黄素组与添加核黄素组各组间差异有统计学意义(P<0.001),添加核黄素组各组间差异无统计学意义,P值分别为0.859、0.128、0.174(图1B);当光照时间为20 min时,不添加核黄素组与添加核黄素组各组间差异有统计学意义(P<0.001),添加核黄素组各组间差异无统计学意义,P值分别为0.076、0.110、0.361(图1C);当光照时间为25 min时,不添加核黄素组与添加核黄素组各组间差异有统计学意义(P<0.001),添加核黄素组各组间差异均无统计学意义,P值分别为0.361、0.361、1.000(图1D)。实验结果证明,在实验时间25 min内,当光照时间到15 min后增加光照时间对病原体灭活效果无影响。

图1 核黄素光化学法病原体灭活后VSV生长量

2.2 核黄素对VSV灭活效果的影响当不添加核黄素时,光照10 min与光照20 min和25 min组差异有统计学意义(图2A);当核黄素浓度为50 μmol/L时,只有光照20 min组和光照25 min组间差异无统计学意义(P=0.235)(图2B);当核黄素浓度为100 μmol/L时,只有光照20 min组和光照25 min组间差异无统计学意义(P=0.658)(图2C);当核黄素浓度为150 μmol/L时,只有光照20 min组和光照25 min组间差异无统计学意义(P=0.474)(图2D)。实验结果表明,当核黄素浓度超过50 μmol/L后,增加核黄素浓度对病原体灭活效果无影响。

图2 核黄素光化学法病原体灭活后VSV生长量

2.3 光照时间与核黄素浓度相互作用对病原体灭活效果的影响总结上述各实验结果可得出结论:在25 min内,光照时间越长,效果越好,VSV生长量越低。与核黄素浓度相比,光照时间的增长比核黄素浓度的增加效果更明显。当核黄素浓度增加到50 μmol/L后再增加核黄素浓度病原体灭活效果不会增强。见表1和图3。

表1 光照时间与核黄素浓度相互作用时实验结果检出VSV生长量log数统计

图3 光照时间与核黄素浓度联合作用灭活病原体后VSV log生长量

3 讨论

核黄素光化学病原体灭活技术在20世纪60年代被发现,通过对这项技术的深入研究表明活性氧介导的非特异性氧化应激以及核黄素分子插入到微生物的RNA和DNA中会对微生物造成损伤[10-12]。到目前为止,在一些欧洲国家核黄素光化学法病原体灭活技术已被运用于临床[13]。

在核黄素联合紫外光照光化学法灭活病原体的实验中,紫外光照剂量增加可有效提高病原体的灭活效果,当紫外光照的时间达到20 min以上时,效果尤为明显。相比于紫外光照剂量增加带来的有效改变,核黄素浓度的增加对于灭活效果有一定的提升,但就不那么显著了。孔令魁 等[14]的早期核黄素紫外光照灭菌实验也证实核黄素浓度12.5～50.0 μmol/L灭活后细菌下,降数与无核黄素的空白对照比较差异有统计学意义(P<0.05);但是随着核黄素浓度的增加灭菌效果趋于下降核黄素浓度>75 μmol/L后无灭菌效果(P>0.05)。

该实验表明,核黄素与紫外光照两者联合对病原体的灭活是具有促进作用的,且差异有统计学意义。该实验结果表明将紫外照射的剂量增加后,紫外光照剂量引起的病原体生长量变化幅度要大于核黄素浓度变化引起的病原体生长量变化。这与Makdoumi et al[15]在对观察紫外光(UVA)活化核黄素对角膜炎中常见的3种细菌的抗菌作用时结果基本一致。这可能是由于紫外线剂量的增加也有可能放大氧化应激产生的数量,然而,核黄素浓度的增加并不一定起到同样的作用。也许只需要少量的核黄素就可以达到所研究的效果,过量的核黄素甚至可以阻止紫外线渗透到液体溶液的深层。同时受试病毒的代谢周期、代谢途径等也可能是影响氧化应激敏感性的因素之一。关于其他作用条件可能会给病原体灭活带来的影响以及其中的作用机制等还需要后续的实验继续深入探索。

该实验表明核黄素联合紫外光A对VSV灭活确实存在一定的疗效,但也存在一定的局限性。本文只验证了核黄素浓度和紫外光A剂量的影响,其他实验表明病原体的灭活也可能与其他因素有关,例如不同的介质、温度、光照距离及其他机械因素。后续实验将进一步探索。

面对各种传染病的威胁,警示了血库和输血医学领域迫切需要有更新的技术创新。由于核黄素光化学病原体灭活的优越性,在保持处理后产品无需清除工作且高质量减少副反应的发生,Mirasol PRT系统可能会被进一步展开研究,其开发应用在未来也具有非常大的潜力。