中国人群外周血RABL6基因甲基化与早期肺癌的关联性研究

黄海霞,乔 荣,李梦夏,顾万建,韩宝惠,杨蓉西

2020年全球癌症数据显示,肺癌(lung cancer,LC)死亡人数位居第一[1-2]。中国LC死亡人数占全球的42%[3]。LC治疗的结局和预后与其初始诊断分期密切关联。据报道[4],I期患者的5年生存率为83%,IV期仅为6%。目前,低剂量计算机断层扫描(low-dose computed tomography,LDCT)筛查是降低LC死亡率的有效方式[5]。使用LDCT对高危人群进行筛查可使特异性病死率降低20%,总病死率降低3.2%[5]。然而,其存在假阳性过高、辐射伤害和成本效益低[5-6]等诸多不足。DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰[7],也是癌症发展的早期事件和伴随事件,可应用于癌症早筛。早期LC,在临床上通常是指Ⅰ期,包括ⅠA期和ⅠB期。课题组前期研究[8-9]也表明,外周血中PNPLA2和FYB等甲基化的改变与早期LC相关。该研究旨在调查RABL6甲基化改变与早期LC之间的关系,评估其作为生物标志物的可能性,为开发基于外周血DNA甲基化来评估早期LC风险的潜在标志物提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 病例资料该研究收集了2018—2019年在上海胸科医院确诊的LC患者275例,年龄29～80 (55.29±10.62)岁,其中男性136例(49.5%),女性139例(50.5%),Ⅰ期224例(81.5%)。病例纳入标准:经病理科和胸外科共同诊断为LC、有完整的临床数据记录、尚未开始放疗或化疗、无其他癌症病史且无来自其他器官的癌症转移。收集LC患者临床信息,包括肿瘤类型、大小、长度、分期和淋巴结受累情况等。见表1。

表1 LC病例的基本临床特征

根据LC患者的年龄性别特征,在上海胸科医院筛选同期诊断为良性结节的患者185例,年龄25～80 (54.77±10.22)岁,其中男性84例(45.4%),女性101例(54.6%)。良性对照纳入标准:经病理诊断为良性肺结节、有完整的临床数据记录且无其他癌症病史等。此外,在江苏省中医院体检中心筛选与LC患者年龄和性别相匹配的健康对照267例,年龄23～80(54.58±10.89)岁,男性132例(49.4%),女性135例(50.6%)。对照纳入标准:所有对照通过胸部X光片检查均为阴性并自述健康、无任何癌症病史或自身免疫性疾病等。该研究方案获得上海市胸科医院和江苏省中医院伦理委员会批准(编号:KS1407)。所有研究对象均签署书面知情同意书。

1.2 样品采集与处理对于LC患者和良性肺结节对照,在进行手术和相关治疗前收集血液样本。使用含EDTA的采血管收集研究对象外周血,并保存于-80 ℃。应用南京腾辰生物科技有限公司的DNA提取试剂盒提取全基因组DNA。

使用DNA甲基化检测样本前处理试剂盒,对DNA进行重亚硫酸氢盐处理。这一过程将未甲基化CpG位点的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。

1.3 基因甲基化水平测定使用EpiDesigner进行引物设计,引物扩增片段大小为298 bp,位于RABL6的第二内含子区(Chr9:139719815-139720112),共包含17个CpG位点,见图1。引物序列上无CpG位点与已知的单核苷酸多态性重合。根据Yang et al[10]的描述,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS,美国Agena Bioscience公司)对基因甲基化水平进行定量检测。对重亚硫酸氢盐处理后的DNA进行PCR扩增。采用虾碱性磷酸酶处理PCR产物,随后用Rnase A进行切割,并用树脂进一步清洗。通过Nanodispenser将产物转移到384 SpectroCHIP中进行检测。数据由SpectroACQUIRE 3.3.1.3软件收集,使用MassArrayEpiTyper 1.2进行可视化处理。由于亚硫酸氢盐处理后未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,因此甲基化和非甲基化DNA会产生不同的切割产物。MassArray仪器能够定量检测甲基化与未甲基化DNA 的比例。其中,RABL6_CpG_1、RABL6_CpG_6.7.8、RABL6_CpG_11.12.13和RABL6_CpG_14.15.16位点因信号质量峰过低或过高无法检测而被排除。

图1 RABL6基因扩增片段示意图、序列和信号峰

1.4 统计学处理采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。根据MALDI-TOF-MS检测原理,该研究中测出来的甲基化值的范围是0～1(即0%～100%),多数学者采用每10%的变化来评估甲基化与结局事件的关联,如Yang et al[10],因此该研究也采用该方式评估RABL6基因甲基化水平每改变10%与早期LC的关联。所有样本使用随机数法排版,将2块384孔板分别编码为1和2。使用无序多分类Logistic回归分析DNA甲基化水平与LC之间的关联,将LC患者设置为参照组,校正年龄、性别和实验批次后,计算RABL6甲基化水平每减少10%的OR和 95%CI。Mann-WhitneyU检验用于分析不同临床特征分组间的甲基化水平差异。所有统计分析均采用双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血RABL6甲基化与LC之间的相关性在275例LC患者、185例良性对照和267例健康对照中,本研究共检测了RABL6基因7个CpG位点的甲基化水平。经校正协变量(年龄、性别和实验批次)的无序多分类Logistic回归分析,在LC患者vs健康对照以及在LC患者vs良性对照中,均未观察到上述RABL6的7个CpG位点甲基化水平与LC之间存在关联 (P>0.05)。见表2。

表2 RABL6甲基化与LC之间的关联

2.2 对患者按性别和年龄分层后分析RABL6甲基化与LC之间的相关性性别、年龄与基因的甲基化的改变有关。为此,本研究对受试者按照性别和年龄分层后,进一步观察RABL6甲基化水平与LC之间的相关性。性别分层后,LC患者vs健康对照中,RABL6_CpG_17甲基化的改变均与LC显著相关,在不同性别中呈现相反的趋势。在女性LC患者中,RABL6_CpG_17的甲基化水平与LC呈负相关,即甲基化水平每减少10%,LC的风险增加1.47倍(OR=2.47,95%CI=1.19～5.13,P=0.016),提示RABL6_CpG_17的甲基化水平升高对于女性可能是保护性因素;而在男性中,RABL6_CpG_17的甲基化水平与LC呈正相关(甲基化水平每减少10%,OR=0.52,95%CI=0.29～0.94,P=0.030),提示RABL6_CpG_17的甲基化水平降低对于男性可能是保护性因素。其余6个CpG位点均未显示出与LC有关联(P>0.05)。而在LC患者vs良性对照中,7个CpG位点的甲基化水平在性别分组中均未显示与LC相关 (P>0.05)。对以上所有P值进行FDR校正后,统计学差异消失。见表3。

表3 性别分层分析RABL6甲基化与LC之间的关联

随后,以中位年龄55岁为界对研究对象进行年龄分层分析。在LC患者vs健康对照中,年龄>55岁患者中RABL6_CpG_2位点的高甲基化与LC相关,即甲基化水平每减少10%(OR=0.77,95%CI=0.60～ 0.99,P=0.038);而在年龄≤55岁的人群中,未发现RABL6甲基化与LC的关联性(P>0.05)。LC患者vs良性对照中,同样在年龄>55岁患者中观察到RABL6_CpG_5位点的甲基化与LC呈正相关,即甲基化水平每减少10% (OR=0.58,95%CI=0.34～0.97,P=0.038)。在年龄≤55岁分组中未观察到其他CpG位点与LC相关 (P>0.05)。对以上所有P值进行FDR校正后,差异无统计学意义。见表4。

表4 年龄分层分析RABL6甲基化与LC之间的关联

2.3 RABL6甲基化与LC临床特征之间的相关性为了解RABL6甲基化水平与LC临床特征之间的相关性,采用Mann-WhitneyU检验比较不同临床特征分组之间RABL6甲基化水平差异。与肿瘤较小(肿瘤长度≤1.5 cm)的患者比较,肿瘤长度>1.5 cm的LC患者RABL6_CpG_17的甲基化水平更高(甲基化的中位数:0.96vs0.97,P=0.026),表明RABL6_CpG_17的高甲基化可能与LC的进展有关。但是其余CpG位点并未显示出这一趋势。尚未发现RABL6甲基化水平与肿瘤类型、淋巴结转移以及肿瘤分期等存在关联(P>0.05)。见表5。

表5 RABL6甲基化水平与不同临床特征之间的关联

3 讨论

RABL6(又名PARF、RBEL1、C9orf86)是Ras超家族中一种新型的Rab亚科成员[11],位于9q34.3,由小型GTP酶组成,参与多种癌症的发生和发展。研究[11-12]表明,RABL6促进食管鳞状细胞癌和胃癌等多种癌细胞的增殖、侵入和迁移,且癌组织中RABL6的表达与食管鳞状细胞癌和非小细胞肺癌的总生存期和无病生存期相关[11,13]。

在RABL6多个CpG位点中,本研究仅观察到RABL6_CpG_17与LC存在显著关联,这提示DNA甲基化具有精确调控的特点[14]。而且这一相关性在男性和女性中呈现出相反的趋势,这可能与男性和女性中各自的性激素及其相关的调控途径以及生活方式(比如吸烟、饮酒)有关。研究表明,不同性别的LC患者生存期存在差异,女性与较长的LC生存期存在显著相关[15],在非吸烟LC患者中,女性的比例远多于男性[16],提示男性和女性中独特的性激素及其相关调控通路的差异性作用。比如,一些信号通路(如cAMP信号通路和卵巢类固醇生成)在非吸烟人群中特异性富集,一些与雌激素功能和MAPK/PI3K信号相关的蛋白(如KRT16、ERBB4和NTF4)在不吸烟的男性和女性LC进展中表现出不同的影响[16]。也有研究[17]表明,性类固醇可能参与非小细胞肺癌的发生和进展。此外,相较于女性,男性中更常见的吸烟、饮酒等与癌症等多种疾病的发生相关的生活方式影响甲基化,进而影响癌症的发生发展,也可能导致在男性和女性中RABL6的不同甲基化状态与LC相关。

癌症是一种与衰老相关的疾病。衰老和癌症具有相似的DNA甲基化改变,包括基因启动子区域的高甲基化,基因体的广泛低甲基化,以及其他累积的表观遗传缺陷,这可能是DNA甲基化介导的和衰老相关的癌症的潜在机制[18]。有研究[19]揭示了人类外周血中白细胞的DNA甲基化水平可能随年龄变化而变化。本研究仅在年龄>55岁的研究对象中观察到RABL6_CpG_2、 RABL6_CpG_5位点的高甲基化与LC之间存在关联,这表明外周血中某些基因的DNA甲基化改变可能是老年人患LC的一种风险。

本研究基于500多例样本的分析,结果显示RABL6基因甲基化在LC患者、良性结节对照和健康对照中存在差异,这为开发基于外周血DNA甲基化评估早期LC风险的潜在标志物提供了新的线索。目前外周血甲基化改变与LC早筛早诊的研究较多,多个基因DNA甲基化改变联合或结合现有诊断技术(如LDCT)应用往往能获得更高的应用价值[20]。因此,随着研究内容的丰富,外周血DNA甲基化有望能为早期LC筛查提供更准确可靠的预测价值。但本文是回顾性且单中心研究,样本的选择可能存在一定的偏倚,而且在收集样本信息时,缺失家族史等暴露信息,在后续的研究中,将通过前瞻性大样本多中心的研究,验证相关的结果,并通过功能实验进一步观察RABL6相关的分子机制。综上所述,该研究表明外周血DNA甲基化可以作为一种新的诊断方法,有望成为精确诊断LC的早期指标。