脑胶质瘤组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达与全切术后复发的关系及意义

王杰 张川

由于脑胶质瘤放化疗的抵抗性、增殖迁移能力强等,导致脑胶质瘤术后复发率较高,因此如何预防及延缓复发是现阶段研究的重点与热点[1]。尽管目前关于脑胶质瘤复发影响因素的研究较多,但缺乏关于分子机制的研究,且根据既往资料,即使是一般资料均衡可比患者,术后复发情况亦不尽相同[2,3],提示有其他机制影响了脑胶质瘤术后的复发。组织配对盒基因3(Pax3)可调控细胞增殖、改变特异细胞系分化、促进细胞自我更新等,下调Pax3的表达可抑制胃癌细胞增殖进展,并能诱导胃癌细胞凋亡[4]。脯氨酰4-羟化酶亚基α1(P4HA1)可改变细胞外基质成分,在肺癌等恶性肿瘤中表达升高,且P4HA1过表达能通过促进肺癌细胞增殖和转移,介导不良预后发生[5]。Rac GTP酶激活蛋白酶1(Rac1)在乳腺癌中,其激活是与放化疗抵抗性相关的预后危险因素[6]。本研究探讨组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达与脑胶质瘤全切术后复发关系及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年3月至2021年6月80例脑胶质瘤全切术患者作为研究对象,其中男51例,女29例;年龄30～69岁,平均年龄(51.69±10.08)岁。根据是否复发分为复发组、未复发组。经本院伦理委员会审核通过。患者及亲属知情,自愿签署同意书。2组年龄、体重指数、性别比、术前KPS评分比较,差异无统计学意义(P>0.05)。复发组病理分级、术后辅助治疗情况与未复发组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组基线资料比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①符合脑胶质瘤诊断标准[7];②具有脑胶质瘤全切术的指征[7];③首次接受治疗,承诺可配合随访;④患者或家属签署知情同意书;⑤年龄>18岁。

1.2.2 排除标准:①合并其他恶性肿瘤及脑部转移瘤者;②脱落、失访者;③身体一般情况较差,不能耐受手术者;④有出血倾向或合并出血类疾病者。

1.3 方法

1.3.1 主要仪器与试剂:Trizol RNA提取试剂盒(美国Thermo Fisher公司);氯仿(武汉易司拓普科技);Quanti Tect 反转录试剂盒(北京天根公司);Taq DNA聚合酶(美国Thermo Fisher公司);dNTP(上海博雅生物);引物设计(上海擎科);PCR缓冲液(武汉卡诺斯科技);实时荧光定量PCR仪(美国MJ,PTC-100型);核酸电泳仪(上海谱振生物EPZ-100);紫外可见分光光度计(美国PHARMACIA公司,UV-2000型)。

1.3.2 组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达检测:取手术切除的脑胶质瘤组织标本,充分研磨后用Trizol RNA提取试剂盒提取RNA。加入氯仿混匀孵育后离心,将上清转移至新的离心管中,加入等体积的异丙醇,孵育、离心、弃上清。75%乙醇洗涤沉淀后离心,真空干燥5 min,加入水溶解RNA,逆转录成cDNA后进行荧光定量聚合酶链反应,反应体系包括上下游引物各1 μl、Taq DNA聚合酶1 μl、cDNA 5 μl、dNTP 1 μl、PCR缓冲液10 μl、ddH2O 2 μl,反应条件:93℃预变性3 min,93℃预变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,40个循环,各检测基因表达量采用分析2-ΔΔCt法。见表2。

表2 Pax3、P4HA1、Rac1基因引物序列

1.4 观察指标 (1)比较2组Pax3、P4HA1、Rac1基因表达;(2)分析脑胶质瘤全切术后复发的相关因素;(3)分析Pax3、P4HA1、Rac1基因表达预测复发的价值;(4)比较不同Pax3、P4HA1、Rac1基因表达水平患者术后复发时间。

2 结果

2.1 2组组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达比较 复发组组织Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA表达高于未复发组(P<0.05)。见表3。

表3 2组组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达比较

2.2 复发多因素分析 校正了病理分级、术后辅助治疗情况后,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA仍是复发的独立相关危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 复发的Logistic回归分析

2.3 组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达预测复发的ROC曲线 绘制各基因预测复发的ROC曲线显示,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA预测复发的AUC依次为0.840、0.825、0.828,采用SPSS的LogP模式构建三者联合预测复发的Logistic预测模型,结果显示其AUC为0.940。见表5,图1。

表5 组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达预测复发的ROC分析结果

图1 组织Pax3、P4HA1、Rac1基因表达预测复发的ROC曲线

2.4 不同Pax3、P4HA1、Rac1基因表达水平患者复发时间比较 Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA高水平患者复发时间短于低水平患者(P<0.05)。见表6。

3 讨论

目前脑胶质瘤仍缺乏行之有效的疗法,即使给予手术+放化疗,患者总体生存率仍较低,其最主要的原因在于术后复发。朱一硕等[8]报道，病理分级、术后辅助治疗情况均与术后复发显著相关,本研究得到了类似的结论,且本研究还发现,校正了病理分级、术后辅助治疗情况后,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1mRNA仍是复发的独立相关危险因素。

表6 不同Pax3、P4HA1、Rac1基因表达水平患者复发时间比较 月,

Pax3 mRNA系胚胎发育过程中一种重要的干细胞转录因子,神经细胞向神经胶质细胞分化过程中,Pax3 mRNA能负性调节神经胶质纤维酸性蛋白,从而影响神经胶质细胞分化过程[9]。沉默Pax3 mRNA被证实可抑制胃癌、前列腺癌等多种癌症进展,故Pax3 mRNA可能是多种恶性肿瘤共享的促癌因子[10,11]。聂德康等[12]报道,表明Pax3 mRNA与脑胶质瘤复发有关。Pax3 mRNA高表达患者脑胶质瘤细胞恶性程度高,增殖、迁移能力强,术后脑胶质瘤细胞自我更新、重生概率较大,所以复发风险增大。Pax3 mRNA预测复发的AUC为0.840,在单一指标中最高,且其单一应用时,预测复发的特异度达90.91%,可作为预测脑胶质瘤术后复发的一个特异性标志物。

P4HA1可调节细胞基质重塑,起到影响肿瘤黏附、迁移等作用,在乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤中均起到促癌因子作用,但在脑胶质瘤患者中的研究较少[13,14]。本研究结果显示,复发组P4HA1 mRNA高于未复发组,与术后复发有关。方胜等[15]体外细胞实验说明P4HA1 mRNA高表达对脑胶质瘤复发起到消极作用。本研究发现,P4HA1 mRNA预测复发的AUC为0.825,敏感度为75.00%,特异度为81.82%,呈现出一定预测价值。可见P4HA1 mRNA有望成为预防脑胶质瘤复发的一个作用靶点,沉默或抑制P4HA1 mRNA表达,可改善肿瘤恶性程度,从而为临床预防脑胶质瘤复发提供了一个新思路。

Rac1 mRNA定位于染色体7p22,被激活后可影响细胞的形态极化,促进细胞骨架重建。本研究显示,复发组Rac1 mRNA表达高于未复发组,与脑胶质瘤术后复发独立相关。一方面高表达的Rac1 mRNA可增强癌细胞的干性,从而增加术后复发的风险;另一方面高表达的Rac1 mRNA可增加脑胶质瘤细胞的放化疗耐性,抑制Rac1 mRNA能通过靶向肿瘤代谢,使癌细胞对DNA损伤剂敏感,进而逆转肿瘤化疗抗性[16,17]。Rac1 mRNA最重要的下游效应器之一是丝氨酸/苏氨酸激酶、p21激活激酶1,而丝氨酸/苏氨酸激酶、p21激活激酶均是癌症易感性的重要物质[18]。因此靶向Rac1 mRNA可能通过癌细胞干性、肿瘤代谢、放化疗敏感性等多个途径,减少脑胶质瘤术后的复发,促进病情的良好转归。但Baker等[19]报道,大量侵袭性癌细胞系显示出的Rac1水平升高,是检测方法造成的误导性结论,具有低Rac1激活水平的癌症仍然显示抗Rac1抗体的高信号,本研究观点与之不同,其原因可能是,以上报道所用的检测方法是免疫荧光分析法,其检测结果依赖于抗Rac1抗体,而本研究采用的是不依赖于抗Rac1抗体的实时荧光定量聚合酶链法,因此能够准确反映脑胶质瘤组织中Rac1 mRNA表达情况。Rac1 mRNA预测复发的AUC与P4HA1 mRNA相近,但Rac1 mRNA的敏感度为83.33%,在单一指标中最高,呈现出独特的应用优势。同时Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA联合Rac1 mRNA预测复发的AUC大于任一单一指标,预测可靠性与预测敏感度进一步提升,故建议联合检测三者作为术后复发的一个预测方案。

在以上研究基础上,本研究还发现,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA高水平患者复发时间短于低水平患者,提示三者的高表达不仅与复发有关,还与患者术后复发时间有关,Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA水平越高,患者术后早期复发的危险度越高。郭合伏等[20]报道,颅内胶质瘤组织高表达的Rac1 mRNA与患者生存期呈负相关,佐证了Rac1 mRNA参与脑胶质瘤的进展。从本研究结果可知,检测患者脑胶质瘤组织标本中Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA表达有助于早期预测患者复发的风险,并初步评估患者复发时间,对Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA高表达患者,应建议患者尽可能完善术后放疗、化疗,并及时调整放化疗方案,而最大化患者受益。

综上,脑胶质瘤组织中Pax3 mRNA、P4HA1 mRNA、Rac1 mRNA表达与全切术后复发及复发时间相关,单一指标中Pax3 mRNA预测特异度最高,Rac1 mRNA预测敏感度最高,三者联合预测复发的可靠性与敏感度进一步提高,能为临床早期精准干预提供重要的参考依据。