隔三七饼灸调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对创伤性骨关节炎大鼠软骨损伤的影响

燕炼钢 周婷 贾泽坤 李静 王储蓄

创伤性骨关节炎(traumatic osteoarthritis,TOA)是骨关节炎(osteoarthritis,OA)的一种亚型,发生于关节损伤后,关节软骨磨损、退化变性为TOA的主要病理改变,造成患者膝关节疼痛、活动障碍[1]。诸多证据表明,炎性反应是介导TOA病理过程重要且不可避免的促成因素,其中核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是介导炎性反应的关键因子,其通过核易位而活化,调控促炎因子表达,诱导炎性发生[2]。蛋白翻译后修饰在NF-κB核易位过程中扮演着重要角色,如经乙酰化、甲基化、磷酸化等,沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)是一种常见的去乙酰化酶,其可诱导NF-κB去乙酰化,从而抑制其核易位,减轻炎性反应[3,4]。而SIRT1在一定程度上受5’磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的调控[5]。故而AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路被认为是抑制炎性反应的重要靶向信号通路。中医将TOA归属于“骨痹”“痹症”范畴[6]。隔药灸为艾灸的形式之一,其较直接灸火力温和,且可实现艾灸和药物双重作用,适用于诸多慢性疾病的治疗[7,8]。三七又名人参三七,有散瘀活血、消肿止痛的功效,且现代药理学研究显示,三七亦具有显著的抗炎疗效[9]。目前已有研究报道隔三七饼灸对OA取得了较好的疗效[10],但其作用机制仍不清楚。基于上述内容,本研究采用经典Hulth方法复制TOA大鼠模型,观察隔三七饼灸对TOA大鼠软骨损伤的影响,并探究调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路作为其药理机制的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级SD大鼠,雄性,体重280～300 g,购自北京华阜康生物公司[许可证号:SYXK(京)2019-0022]。喂养环境:12 h光/12 h暗交替模式,温度22～26℃,湿度40%～55%,自由摄食、进水。

1.2 主要试剂 三七粉、艾绒由本院中药房提供;AMPK抑制剂Compound C(MedCheExpress公司);HE染色、番红-固绿染色试剂盒(上海源叶生物公司);一氧化氮(NO)检测试剂盒、RIPA裂解液、核蛋白抽提试剂盒、BCA试剂盒(均碧云天生物公司);白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)Elisa检测试剂盒(均上海酶研生物公司);基质金属蛋白酶(MMP)-1,3 Elisa检测试剂盒(均武汉华美生物工程有限公司);兔源一抗Ⅱ型胶原蛋白(Collagen Ⅱ)、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、SIRT1、乙酰化NF-κB(ac-NF-κB)、anti-Histone H3、anti-GAPDH(均Abcam公司);兔源一抗NF-κB(北京百奥莱博科技公司);山羊抗兔二抗(Absin公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验药物制作:①三七饼制作法:取三七粉10 g,加入5 ml 60%酒精调制为浓稠糊状,随后做成直径约3 cm、厚约0.8 cm的饼状,用针在饼中间刺10个小孔,利于艾灸热力的传导。②艾炷制作法:取艾绒2 g,反复揉搓使之紧实,随后通过边旋转、边捏,使其变成圆锥形(上尖下平)的艾炷。

1.3.2 实验分组及模型构建:随机把40只大鼠分为假手术(sham)组、TOA组、隔三七饼灸组、扶他林组、隔三七饼灸+AMPK抑制剂组,每组8只。采用经典Hulth方法复制TOA模型[11],将大鼠麻醉后固定,消毒膝关节后打开关节腔,切断前后交叉韧带,移除内侧半月板,sham组仅做打开关节腔处理。术后抗炎3 d。术后1周根据分组进行干预。

1.3.3 治疗方法:将隔三七饼灸组大鼠麻醉、固定于鼠台上,参考《小动物针灸法手册》对其进行穴位定位,取足三里穴、肾俞穴并进行备皮,将三七饼置于穴位上,艾炷置于三七饼上方,随后开始艾灸,每次每穴灸5个艾炷(药饼烤干时及时更换),以灸侧皮肤红润且不起泡为度,隔日1次,10次为1个疗程,共治疗2个疗程(疗程间隔5 d);隔三七饼灸+AMPK抑制剂组在隔三七饼灸组处理基础上腹腔注射AMPK抑制剂,每次10 mg/kg,1次/周,连续给药3周;对扶他林组大鼠行膝关节周围备皮,而后均匀涂抹扶他林,2次/d,10次为1个疗程,共治疗2个疗程(疗程间隔5 d)。

1.3.4 HE染色和番红-固绿染色观察软骨组织病理改变:于末次给药后次日,处死大鼠,取出膝关节软骨组织,将一部分经4%多聚甲醛固定24 h后置于EDTA脱钙液中脱钙15 d,随后进行组织脱水、石蜡包埋、切片(4 μm厚),进行常规HE染色和番红-固绿染色,于显微镜下观察分析,并进行Mankin’s评分[12],得分越高表示病变越严重。剩余软骨组织保存于-80℃备用。见表1。

1.3.5 免疫组化检测软骨组织中Collagen Ⅱ 阳性表达情况:取2.4制作好的切片,常规脱蜡水化处理后进行抗原修复,而后浸于3%H2O2溶液中10 min以灭活过氧化物酶活性,浸于5%山羊血清中封闭非特异性位点,而后孵育兔抗大鼠一抗Collagen Ⅱ(4℃过夜),次日孵育山羊抗兔二抗(37℃ 30 min),DAB显色液孵育5 min,苏木精复染2 min,而后脱水、透明、封片,于显微镜下观察,利用Image J软件进行定量分析。

表1 Mankin’s评分标准

1.3.6 检测软骨组织中炎性介质水平:取1.3保存的软骨组织,匀浆后离心收集上清,采用NO检测试剂盒,IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-13 Elisa检测试剂盒测定上清中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-13水平。

1.3.7 Western Blot检测软骨组织中AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白表达情况:取1.3.4保存的软骨组织,利用RIPA裂解液提取总蛋白或利用核蛋白抽提试剂盒提取核蛋白,BCA法测定浓度,加入2×蛋白上样缓冲液定量后进行沸水浴变性,而后经凝胶电泳分离蛋白、转模,5%脱脂奶粉封闭后孵育兔源一抗AMPK、p-AMPK、SIRT1、NF-κB、ac-NF-κB、anti-Histone H3、anti-GAPDH(4℃过夜),次日孵育山羊抗兔二抗(室温2 h),最后滴加ECL显色剂、置于凝胶成像系统中拍照,最后借助Image J软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 5组软骨组织病理改变 Sham组软骨表面光滑,软骨细胞丰富、排列整齐;TOA组软骨层变薄,表面出现裂隙样破坏,软骨细胞大量减少、排列紊乱,蛋白多糖明显丢失,Mankin’s评分增高,经隔三七饼灸或扶他林干预后,软骨组织病变明显减轻,Mankin’s评分下降,且隔三七饼灸干预改善更明显;隔三七饼灸+AMPK抑制剂组较隔三七饼灸组软骨病变加重,Mankin’s评分增高。见表2,图1。

表2 5组软骨组织Mankin’s评分 n=8,分,

2.2 5组软骨组织中Collagen Ⅱ阳性表达情况 与Sham组比较,TOA组软骨组织中Collagen Ⅱ阳性表达下降(P<0.05);与TOA组比较,隔三七饼灸组、扶他林组软骨组织中Collagen Ⅱ阳性表达增高,且隔三七饼灸组增高更明显(P<0.05);与隔三七饼灸组比较,隔三七饼灸+AMPK抑制剂组软骨组织中Collagen Ⅱ阳性表达下降(P<0.05)。见图2,表3。

图1 5组软骨组织病理改变(×200)

图2 Collagen Ⅱ免疫组化染色(×200)

表3 5组软骨组织中Collagen Ⅱ阳性表达情况 n=8,

2.3 5组软骨组织中炎性介质水平 与Sham组比较,TOA组软骨组织中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平增高(P<0.05);与TOA组比较,隔三七饼灸组、扶他林组软骨组织中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平下降,且隔三七饼灸组下降更明显(P<0.05);与隔三七饼灸组比较,隔三七饼灸+AMPK抑制剂组软骨组织中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平增高(P<0.05)。见表4。

表4 5组软骨组织中炎性介质水平 n=8,

2.4 4组软骨组织中AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白表达 与Sham组比较,TOA组软骨组织中p-AMPK、SIRT1蛋白表达下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表达增高(P<0.05)(P<0.05);与TOA组比较,隔三七饼灸组软骨组织中p-AMPK、SIRT1蛋白表达增高,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表达下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与隔三七饼灸组比较,隔三七饼灸+AMPK抑制剂组软骨组织中p-AMPK、SIRT1蛋白表达下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表达增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5,图3。

表5 4组软骨组织中AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 n=8,

图3 AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白Western Blot条带图;A Sham组; B TOA组;C 隔三七饼灸组;D 隔三七饼灸+AMPK抑制剂组

3 讨论

TOA为OA的一种常见类型,易发生于膝盖、脚踝、肘关节、腕关节等部位,其发病率越来越高[1]。目前认为,长期的炎性刺激是介导TOA发病的主要病理基础,NO、IL-1β、TNF-α等为常见的炎性因子,不仅可抑制软骨细胞的增长,还可诱导MMP-1、MMP-3等蛋白酶的产生,使软骨中的胶原蛋白及蛋白多糖被分解,进而导致软骨损伤[13,14]。本研究结果显示,相比于Sham组,TOA组软骨组织软骨层变薄,表面出现裂隙样破坏,软骨细胞大量减少,蛋白多糖明显丢失,Mankin’s评分增高,同时MMP-1、MMP-3水平增高,Collagen Ⅱ阳性表达下降,此外,NO、IL-1β、TNF-α水平增高,表明TOA大鼠软骨组织存在明显炎性反应及软骨损伤。

临床研究显示,非甾体抗炎药如扶他林为临床治疗TOA的常用药物,可在一定程度上消炎、镇痛,但效果仍不尽理想[15]。笔者发现近年来,研究者逐渐把目光投向了我国的传统医学。TOA属传统医学“骨痹”“痹症”范畴,主要病机为外伤或劳损致气血瘀滞,经络闭阻,不通则通,筋骨失养,久之骨节偏枯,关节失动[16]。艾灸是传统医学的特色外治方法之一,主要借助灸火的热力,通过经络传导,以达到散瘀散节、活血行气的功效[17]。

隔药灸为艾灸的一种常见形式,可实现艾灸和药物的双重作用。已有大量研究报道隔药灸对OA及类风湿性关节炎具有显著的疗效[7,8]。在本研究中,我们选用三七作为隔药灸的药物,其不仅具有化瘀、散血、止痛的功效,亦具有抗炎的功效[9]。足三里穴、肾俞穴为常用的防病强壮穴,其中足三里穴具有扶正祛邪,补气益中、通经活络的功效;肾俞穴不仅可温阳补肾,强化骨骼,且可疏通诸阳经经气,使经络通畅,二者综合使用,可达到相互滋生、兼顾的功效[18,19]。本研究结果表明隔三七饼灸能够抑制TOA大鼠软骨组织炎性反应,减轻软骨损伤,且效果显著。

SIRT1/NF-κB是介导炎性反应的重要信号通路之一,且该通路已被大量研究证实与OA的发生和进展密切相关,其作用机制为SIRT1是一种去乙酰化酶,通过诱导NF-κB去乙酰化而抑制其核易位,进而抑制炎性因子的释放[3,4]。此外,诸多研究表明AMPK磷酸化活化后可调控SIRT1表达,激活SIRT1/NF-κB通路[5]。

为了探究调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路是否为隔三七饼灸的可能药理机制,我们首先检测了隔三七饼灸干预后,TOA大鼠软骨组织中AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化,结果发现p-AMPK、SIRT1蛋白表达下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表达增高,提示隔三七饼灸能够调控AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路。然后我们在隔三七饼灸干预的同时给予AMPK抑制剂Compound C干预,结果发现TOA大鼠软骨组织炎性反应及损伤加重,证实调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路为隔三七饼灸的药理机制。

综上所述,隔三七饼灸能够减轻TOA大鼠软骨损伤,可能与调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路有关。希望本研究能为隔三七饼灸应用于治疗TOA提供参考依据。