绿原酸调控内质网应激PERK-CHOP通路对安氟烷诱导大鼠肝毒性的保护作用

张思思 蔡英敏 王武涛 乔艳

卤代吸入麻醉剂是目前被广泛应用于全身麻醉的一种药物,但其对肝脏有不同程度的损伤[1]。安氟烷是卤代吸入麻醉剂中的一种,产生作用缓慢,常与其他药物一起诱导麻醉,尽管其肝毒性较低于氟烷,但依然能够在术后引起急性肝损伤[2]。因此,深入研究术后麻醉剂诱导的肝损伤机制及其预防途径是必要的。绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)是一种多酚,多存在与咖啡、山楂、山药、金银花等物质中,具有抗炎、抗菌、抗癌以及神经保护等多种作用[3]。研究已经证实,CGA能够减轻他莫昔芬介导的肝肾损伤,同时也可以通过抑制内质网应激减轻肾损伤[4,5]。内质网(ER)应激是由ER内积累的未折叠或错误折叠蛋白激活的未折叠蛋白反应(UPR)。蛋白激酶RNA样ER激酶(PERK)是介导UPR的信号通路的上游因子之一,其磷酸化能够诱导下游真核翻译起始因子2α(eIF2α)磷酸化,激活促凋亡转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达,促进细胞凋亡[6]。目前已经发现,通过抑制ER应激可以降低肝细胞中的炎性体活化改善肝损伤,也可以降低细胞凋亡率减轻药物诱导的肝损伤[7]。因此,基于上述了解,本研究利用安氟烷诱导大鼠产生肝损伤,探讨CGA保护大鼠肝毒性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠60只,8周龄体重160～200 g,购于卡文斯百格(苏州)模式动物研究有限公司,许可证号：SCXK(苏)2018-0002。大鼠均在温度24～26℃,湿度60%的环境中适应性饲养3 d。

1.2 药品及试剂 安氟烷(上海雅培制药有限公司);PERK激活剂CCT020312(CCT,货号：HY-119240,MedChemExpress);天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(货号：EK-R38215、EK-R37339、EK-R37579,上海酶研生物科技有限公司);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(货号：G1120,北京索莱宝科技有限公司);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号：40307ES20,翌圣生物科技股份有限公司);BCA检测试剂盒(货号：JLC-G7687,江西江蓝纯生物试剂有限公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(货号：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005,北京索莱宝科技有限公司);PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP一抗(货号：ab79483、ab192591、ab169528、ab227593、ab11419,英国Abcam公司);山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP(货号：GARG80-0500、AS16-3715,艾美捷科技有限公司);BCL2、BAX(货号：ab32124、ab32503,英国Abcam公司);酶标仪(型号：ELx808,美国Bio-Tek公司);倒置荧光显微镜(型号：IX83,仪景通光学科技有限公司);iBright凝胶成像仪(型号：CL750,赛默飞世尔科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分组、造模和给药：将所有大鼠随机分为对照组、模型组、CGA低剂量组、CGA高剂量组、CGA高剂量+PERK激活剂组(CGA-H+CCT组),每组12只。除对照组外,其他组均以2 L/min的流量吸入1.7%的安氟烷4 h[8];对照组相同条件吸入等量的氧气;CGA低、高剂量组在吸入安氟烷1 h前分别以10 mg/kg、50 mg/kg的剂量开始灌胃给药[9];CGA-H+CCT组先腹腔注射1 mg/kg的PERK激活剂CCT020312[10],再灌胃50 mg/kg的CGA;对照组和模型组均灌胃等体积的纯净水。2次/d,持续5 d。

1.3.2 检测大鼠血清中肝功能指标AST、ALT、ALP的活性：所有大鼠在实验结束后进行尾静脉采血5 ml,3 000×g,4℃离心15 min,收集上清并保存于-20℃,备用。试剂盒检测大鼠血清AST、ALT、ALP的活性。

1.3.3 检测血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平：按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒的步骤制作标椎曲线,然后将血清分别与不同的生物素化抗体反应完全后,检测450 nm处的OD值,再根据标准曲线计算TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度。

1.3.4 HE染色观察大鼠肝组织的病理变化：采血结束后,所有大鼠用1%的戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)麻醉并处死,解剖并分离肝脏组织,部分(n=6)固定于4%多聚甲醛溶液中进行石蜡包埋并切片,剩余组织(n=6)保存于-80℃。将石蜡切片用二甲苯和乙醇浸泡脱蜡后,使用HE染色液进一步染色,并用PBS冲洗切片。光学显微镜下观察肝组织的病理变化。

1.3.5 TUNEL染色检测大鼠肝细胞凋亡：取1.3.4中的石蜡切片进行脱蜡、再水化,然后用蛋白酶K稀释液孵育30 min。接着将切片置于50 μl准备好的TUNEL工作液中,37℃避光孵育1 h,再用DAPI在避光条件下复染10 min,最后用PBS洗涤并封片。荧光显微镜下观察488 nm处细胞的凋亡情况。

1.3.6 Western blot检测大鼠肝组织中ER应激蛋白PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP的表达：将1.3.4中冻存的组织(n=6)匀浆,制备蛋白样品并测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白,并转移至PVDF膜上。将PVDF膜用脱脂奶粉封闭液4℃过夜孵育,然后分别加入PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP一抗(PERK、eIF2α稀释比例,为1∶500,p-PERK、p-eIF2α稀释比例为1∶1 000,CHOP稀释比列为1∶200)室温孵育1 h。洗膜后分别加入羊抗兔或羊抗小鼠稀释液(稀释比例均为1∶5 000)室温孵育1 h。洗膜后用ECL显影剂显影,用凝胶成像仪成像。以GAPDH为内参蛋白,利用Image J对目的蛋白进行定量分析。

1.3.7 免疫组化法检测大鼠肝组织中BCL2、BAX蛋白水平 将1.3.4中石蜡切片脱蜡再水化,然后将切片放在封闭液中封闭2 h,再与BCL2、BAX一抗稀释液(稀释比例为1∶1 000)在4°C孵育过夜,PBS清洗后与羊抗兔二抗(稀释比例均为1∶5 000)一起孵育1 h,PBS清洗后用DAB染色,苏木素复染。使用Image J软件分析并计算BCL2、BAX阳性表达区域光密度值。

2 结果

2.1 CGA对安氟烷诱导的大鼠血清中AST、ALT的影响 与对照组比较,模型组大鼠的血清中AST、ALT、ALP活性升高(P<0.05);与模型组比较s,CGA低、高剂量组血清中AST、ALT、ALP活性降低(P<0.05),且CGA高剂量组AST、ALT、ALP活性低于低剂量组(P<0.05);与CGA高剂量组比较,CGA-H+CCT组血清中AST、ALT、ALP活性升高(P<0.05)。见表1。

表1 CGA对大鼠血清中AST、ALT、ALP活性的影响 n=12,U/L,

2.2 CGA对安氟烷诱导的大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的影响 与假手术组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);与模型组比较,CGA低、高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05),且CGA高剂量组炎性因子水平低于低剂量组(P<0.05);与CGA高剂量组比较,CGA-H+CCT组组TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CGA对大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响 n=12,pg/ml,

2.3 CGA对安氟烷诱导的大鼠肝组织病理形态的影响 与对照组相比,模型组大鼠肝细胞数量减少,排列不规则,且出现肿胀和空泡;与模型组相比,CGA低、高剂量组大鼠肝细胞数量增多且排列有序,有轻微肿胀,空泡减少;与CGA高剂量组相比,CGA-H+CCT组肝组织的病理损伤加重。见图1。

对照组 模型组 CGA低剂量组 CGA高剂量组 CGA-H+CCT组

2.4 CGA对安氟烷诱导的大鼠肝细胞凋亡的影响 与对照组比较,模型组大鼠中肝细胞的凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,CGA低、高剂量组大鼠肝细胞的凋亡率降低(P<0.05),且CGA高剂量组凋亡率低于低剂量组(P<0.05);与CGA高剂量组比较,CGA-H+CCT组大鼠肝细胞的凋亡率升高(P<0.05)。见图2,表3。

对照组 模型组 CGA低剂量组 CGA高剂量组 CGA-H+CCT组

表3 CGA对大鼠肝细胞凋亡的影响 n=6,%,

2.5 CGA对安氟烷诱导的大鼠肝组织中PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白的影响 与对照组比较,模型组大鼠肝组织中p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,CGA低、高剂量组肝组织p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表达升高(P<0.05),且CGA高剂量组蛋白表达高于低剂量组(P<0.05);与CGA高剂量组比较s,CGA-H+CCT组肝组织中p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表达降低(P<0.05)。各组PERK、eIF2α蛋白无显著变化(P>0.05)。见图3、表4。

图3 大鼠肝组织中ER应激通路相关蛋白的表达;A 对照组;B 模型组;C CGA低剂量组;D CGA高剂量组;E CGA-H+CCT组

表4 CGA对大鼠肝组织中ER应激通路相关蛋白表达量的影响 n=6,

2.6 CGA对安氟烷诱导的大鼠肝组织中BCL2、BAX蛋白的影响 与对照组比较,模型组大鼠肝组织中BCL2蛋白表达减少,BAX蛋白表达增加(P<0.05);与模型组比较,CGA低、高剂量组大鼠肝组织中BCL2蛋白表达增加,BAX蛋白表达减少(P<0.05);与CGA组比较,CGA-H+CCT组大鼠肝组织中BCL2蛋白表达减少,BAX蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4,表5。

对照组 模型组 CGA低剂量组 CGA高剂量组 CGA-H+CCT组

表5 CGA对安氟烷诱导的大鼠肝组织中BCL2、BAX蛋白表达的影响 n=6,光密度,

3 讨论

肝脏是许多药物代谢的重要场所,而药物导致的肝毒性也是常见的死亡因素之一。因此,深入了解肝毒性的机制对预防药物性肝损伤至关重要[11]。在常用的卤代麻醉剂中,安氟烷被证明与氟烷一样,能够引起肝毒性,但发生率低于氟烷。安氟烷诱导的肝损伤特点与氟烷一致,即血清中肝酶的急性升高[2]。据了解,肝损伤机制的核心是氧化应激和炎性反应,而目前大多数药用植物及其化学物质能够产生抗炎、抗氧化的作用[12]。CGA便是其中一种多酚类物质,能够通过间接抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6来发挥抗炎作用[13]。本研究结果显示,模型组大鼠血清中肝功能指标AST、ALT、ALP以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高,且HE染色观察到肝细胞数量减少,排列不规则,且出现肿胀和空泡等。揭示了安氟烷成功诱导大鼠肝毒性损伤。当CGA给药后,肝功能指标AST、ALT、ALP以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低,肝细胞数量增多且排列有序,有轻微肿胀,空泡减少。表明了CGA能够减轻安氟烷诱导的肝毒性损伤,但其作用机制还未深入研究。

ER应激的主要反应是葡萄糖调节蛋白78(GRP78)通过与其跨膜受体解离而激活PERK、肌醇需要蛋白1(IRE-1)和激活转录因子6(ATF6)三个通路上游因子[14]。在ER应激发生后,PERK作为一种胞质激酶,能够通过反式自磷酸化,促使eIF2α的磷酸化,从而减少蛋白质的翻译[15]。CHOP可以调节多种凋亡相关基因的表达,包括BCL2蛋白家族的抗凋亡蛋白BCL2,以及促凋亡蛋白BAX[16]。本研究结果发现,模型组大鼠的肝细胞凋亡率升高,PERK和eIF2α的磷酸化水平、CHOP和BAX蛋白表达均升高,BCL2蛋白表达降低,推测ER应激条件下的细胞功能障碍和细胞死亡是安氟烷诱导的肝毒性损伤的病理因素,PERK信号通路的激活能够触发促凋亡信号,从而促进细胞凋亡[17]。本研究中,CGA组大鼠肝细胞凋亡率降低,PERK和eIF2α的磷酸化水平、CHOP和BAX蛋白表达均降低,BCL2蛋白表达升高。揭示了CGA能够抑制安氟烷诱导的肝细胞凋亡,从而减轻肝毒性,其作用可能是通过抑制ER应激通路中PERK的磷酸化以及促凋亡转录因子CHOP的表达。进一步加入PERK的激活剂CCT发现,CCT消除了CGA对上述肝功能指标、炎性因子以及凋亡相关因子的作用。

综上所述,CGA可能通过抑制ER应激PERK-CHOP通路来减轻安氟烷诱导的大鼠肝毒性。本研究为预防药物肝毒性提供了新的研究思路和方法。但PERK通路还存在许多下游调节因子,因此,PERK-CHOP通路之间的具体作用机制以及相互作用还有待进一步的深入探索。