垂体腺瘤环状RNA Hsa_circ_0043459表达水平与术后复发的相关性

胡长伟 王希瑞 李亚斌 任宝文 韩晓勇 尹港峰

垂体腺瘤约占颅内肿瘤的15%,是较常见的颅内肿瘤之一,人口发病率为8.2%～14.7%[1]。虽然大多数的垂体腺瘤都是良性肿瘤,但其术后复发率却高于其他颅内良性肿瘤,有文献报道,垂体腺瘤的术后复发率可达4%～44%[1]。复发垂体腺瘤中以无功能性垂体腺瘤居多,但功能性垂体腺瘤的复发会带来更多的临床症状。无论是功能性还是无功能性垂体腺瘤的复发对于患者的预后生存期和生活质量都有较大影响。目前普遍认为垂体腺瘤的复发与肿瘤的侵袭性生长和术中切除程度等临床特点有关。而目前对于垂体腺瘤术后复发的具体机制及相关因素并不明确。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种共价连续的内源性闭合环状RNA,因其不含5,和3,端,不易被核酸外切酶降解,因此其结构比线性RNA稳定[2]。近期随着RNA微阵列芯片和高通量测序技术的发展,发现在真核生物细胞内存在多达数千种以上的具有组织特异性的环状RNA。特定的顺式作用元件和反式作用因子影响着其生物发生的过程。研究发现在人类各种组织和体液中都有丰富的环状RNA,而且部分环状RNA可能与前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等的发生发展有密切关系[3]。环状RNA的丰富表达谱和高稳定性,使其有可能被开发为多种肿瘤预后预测的标志物或治疗靶点[4]。本研究探讨hsa_circ_0043459在垂体腺瘤中的表达情况及其与垂体腺瘤术后复发的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年6月至2019年6月我院手术切除的垂体腺瘤组织120例,其中男64例,女56例;年龄22～73岁,平均年龄(50.03±11.31)岁;功能性垂体腺瘤59例,侵袭性垂体腺瘤31例,肿瘤全切或次全切除78例。选择同期颅脑损伤内减压术切除的正常脑组织20例作为对照,其中男11例,女9例;年龄33～71岁,平均年龄(51.30±11.27)岁。2组患者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。患者术后均经病理检查证实为垂体腺瘤,术后定期复查,随访依从性良好。复发诊断标准：(1)首次术后病理证实为垂体腺瘤;(2)首次术后再次出现肿瘤相关症状,影像学显示肿瘤占位效应明显,术后病理证实为垂体腺瘤。排除标准：术前3个月内有溴隐亭或其他生长激素抑制剂或放射治疗史;合并有其他恶性肿瘤或内分泌系统疾病;合并心、肝、肾功能或其他严重系统功能不全患者。

1.2 手术方式 患者均采用神经内镜下经鼻蝶入路垂体腺瘤切除手术。手术方式：术前碘伏常规消毒双侧鼻腔周围的面部区域,稀释后的碘伏溶液消毒双侧鼻腔内。德国齐柏林公司神经内镜I020260系统,镜下用浸泡1∶5稀释的肾上腺素的棉片收缩鼻甲及鼻腔黏膜约5 min。对于肿瘤较大的患者,采用部分切除中鼻甲的扩大经蝶入路。术中切除鼻中隔后半部分黏膜,采用单侧鼻腔或双侧鼻腔通道。磨钻磨除蝶窦前壁的骨质,清除蝶窦内黏膜和骨性分隔,显露鞍底。磨除鞍底骨质后,切开鞍底硬脑膜,暴露肿瘤组织,标本钳留取部分肿瘤组织做病理用。对于质地较软的肿瘤组织常以刮圈和显微吸引器配合切除,按由底到侧再到顶的顺序逐步切除肿瘤;对于质地较韧的肿瘤,先由萨米刀或显微剪刀分离,然后分块切除。肿瘤切除完成后,瘤腔内填塞明胶海绵压迫止血。0.9%氯化钠溶液反复冲洗术野无明显活动性出血后,人工硬脑膜进行鞍底重建。术中发生明显脑脊液漏患者,需取大腿外侧脂肪、筋膜和肌肉,以“三明治”方法进行鞍底多层修补。最后于鼻腔内填塞膨胀海绵或碘仿纱条。

1.3 实时荧光定量PCR法检测hsa_circ_0043459的表达 Trizol法提取组织标本中的总RNA,紫外分光光度计测定其在波长260 nm及280 nm处的吸光度(OD)比值,测定RNA浓度。选用 OD 260/280 比值1.8～2.1间的标本。使用逆转录试剂盒将RNA样品逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR仪检测垂体腺瘤组织和正常脑组织中的hsa_circ_0043459的表达水平,内参为U6。引物序列为上游：5’-GCCCTGGTCACCTACAACAC-3’,下游：5’-TGGATATCAGGGACAGGCAGT-3’; U6引物上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’,下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以上实验操作均重复3次。

1.4 随访 患者术后均随访2年以上,随访截止时间为2021年6月。按患者术后次日计算至术后复发确诊或截止时间,术后复发时间以月为统计单位。

2 结果

2.1 正常脑组织和垂体腺瘤中hsa_circ_0043459的表达比较 垂体腺瘤组织中hsa_circ_0043459的表达水平高于正常脑组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 正常脑组织和垂体腺瘤中hsa_circ_0043459的表达比较

2.2 复发和未复发垂体瘤组织中hsa_circ_0043459表达比较 120例垂体腺瘤患者中,术后随访发现,术后复发23例,复发率为19.17%。按是否术后复发将120例患者分为复发组和未复发组,复发组的垂体腺瘤中hsa_circ_0043459的表达高于未复发组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 复发和未复发垂体瘤组织中hsa_circ_0043459的表达

2.3 垂体腺瘤中hsa_cric_0043459高表达组与低表达组复发情况比较 120例垂体腺瘤组织按hsa_circ_0043459的相对表达水平的平均值(3.26),分为高表达组(≥3.26)49例和低表达组(<3.26)71例。hsa_circ_0043459高表达组的术后复发率为36.73%明显高于低表达组的7.04%,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 垂体腺瘤中hsa_cric_0043459高表达组与低表达组复发率比较 例(%)

2.4 不同hsa_circ_0043459表达水平对垂体腺瘤复发时间的影响 统计垂体腺瘤患者中hsa_circ_0043459高表达组和低表达组术后复发的时间。Kaplan-Meier生存曲线分析方法显示,高表达组术后复发时间(18.55±1.06)月明显较低表达组(23.21±0.35)月缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 Kaplan-Meier生存曲线分析hsa_circ_0043459高表达和低表达组垂体腺瘤术后复发时间

2.5 垂体腺瘤患者术后复发相关风险因素回归分析 hsa_circ_0043459的表达高低与垂体腺瘤术后复发存在正相关的关系(P<0.05),且肿瘤侵袭和肿瘤切除程度与垂体腺瘤复发也存在着显著相关性(P<0.05)。见表4。

表4 垂体腺瘤患者术后复发Logistic相关风险因素回归分析

3 讨论

垂体腺瘤又称垂体瘤,是一种较为常见的颅内肿瘤,临床症状主要表现在两方面：(1)内分泌功能障碍,主要表现为泌乳、闭经、月经紊乱、肢端肥大、向心性肥胖、多饮多尿等激素紊乱相关性症状;(2)占位引发的颅内神经功能障碍,主要表现为视力下降、视野缺损、头痛、精神症状、嗅觉下降等神经功能障碍。垂体腺瘤的诊断主要根据临床表现、内分泌学检查及影像学定位诊断。临床治疗手段主要包括药物治疗、放射治疗及手术治疗,其中手术治疗是垂体腺瘤的重要治疗手段。由于垂体腺瘤的解剖位置的特点,大部分垂体腺瘤首选经鼻蝶手术切除。目前因神经内镜具有较好视野以及良好照明,由于其具有成角视野,术中视野盲区较小,可有效提升肿瘤切除率,还可降低因视野不佳导致术区周围组织受损的概率; 其次神经内镜手术仅需要较小操作空间,且术中无需将骨性鼻中隔切除,可降低对于鼻黏膜的创伤,术后恢复快,缩短住院时间。神经内镜已逐渐取代传统显微镜在经蝶手术中的应用[5,6]。目前神经外科采取最多的是神经内镜下经鼻蝶入路垂体腺瘤切除术。神经内镜下经鼻蝶入路垂体腺瘤切除术,因其具有治愈率高、创伤性小及并发症少等明显优点,已经成为垂体腺瘤患者的首选微创术式。

垂体腺瘤虽然绝大多数是良性肿瘤,但由于部分垂体腺瘤可能侵袭海绵窦和颈内动脉或进入第三脑室以及与周围重要解剖结构关系密切等原因,因此术后复发率高于其他颅内良性肿瘤。其较高的复发率仍是目前临床上在对垂体腺瘤治疗中的一大困扰。对于垂体腺瘤术后复发的主要临床相关因素,有报道认为,对年龄在18～45岁,肿瘤大部分及部分切除,肿瘤最长径更长,具有侵袭性的无功能性垂体腺瘤病人,术后更容易复发[7,8]。侵袭性生长可认为是垂体腺瘤的独立危险因素[9,10]。但对于垂体腺瘤复发的具体机制目前尚不明确。有研究认为Ki-67高表达的垂体腺瘤,术后更易复发[11,12]。另有研究报道,垂体瘤转化基因、增殖细胞核抗原、长链非编码核糖核酸MEG3、长链非编码核糖核酸(lncRNA)POU3F3等基因表达产物很可能参与了垂体腺瘤的复发[13-15]。但多数分子标记物在预测垂体腺瘤复发方面均没有特异性或稳定性。目前尚没有一种分子产物可以均具有特异性和稳定性的作为垂体腺瘤术后复发的标记物,用来提示垂体腺瘤的预后和复发。

环状RNA是近年来逐渐被关注的一种新兴分子。环状RNA是一类内生的、数量众多的、稳定存在于哺乳动物细胞中的分子,具有一定的组织、时序和疾病特性[16]。环状RNA与传统的线性RNA不同,其分子结构呈封闭环状。因此,环状RNA不会受RNA外切酶的影响,不易被降解。越来越多的研究发现,环状RNA分子内部含有多个 miRNA的结合位点,环状RNA可以通过与疾病相关联的miRNA相互作用,可解除miRNA对其靶基因的抑制作用,而发挥重要的调控作用。环状RNA可以通过内源性竞争抑制miRNA结合,调控母基因表达,调控RNA 结合蛋白等的作用完成相关靶向分子的调控[17,18]。环状RNA因其在体内广泛分布和不易被核酸酶降解的稳定性,越来越多的研究注重于环状RNA与各种肿瘤的发生、发展机制及预后预测的关系,期望环状RNA可以作为肿瘤生物学行为的分子预测靶点[19-21]。同样,在垂体腺瘤中也有部分研究显示,一些环状RNA可能与垂体腺瘤的侵袭生长或复发相关[22]。

在生物信息学方面,有学者已经开始了垂体腺瘤相关环状RNA方面的研究。有研究报道利用RNA芯片技术对73例无功能性垂体腺瘤患者的环状RNA表达谱进行了初步检测;在7 481个环状RNA中,采用cox比例风险回归模型和随机生存森林算法分析比对后,挑选了与垂体腺瘤生长或复发密切相关的9个环状RNA,然后用风险评分生存预测方法分析,结果表明将hsa-circ-0000066和hsa-circ-0069707两种环状RNA组合的风险评分的ROC曲线下面积最大,预测能力也最高[23]。表明hsa-circ-0000066和hsa-circ-0069707的联合作用,在无功能性垂体腺瘤组织中可能与肿瘤生长机制相关。另一项研究通过将无功能性垂体腺瘤分为侵袭性和非侵袭性2组,并检测其肿瘤组织中环状RNA的表达谱,在侵袭性无功能性垂体腺瘤中发现有152个环状RNA呈显著异常表达,其中91种环状RNA呈上调趋势,而61种环状RNA呈下调趋势。在61种下调趋势的环状RNA中,hsa-circRNA-102597表达水平的降低与肿瘤的直径和肿瘤的Knosp分级密切相关(P<0.05);其认为Ki-67指数和hsa-circRNA-102597低表达水平的组合可能是垂体腺瘤侵袭生长和预后的有效预测标志物;该研究还通过生物信息学分析进一步发现,CDKNlA、WNT4和EGFR等基因可能会是hsa-circRNA-102597 和miRNA调控网络的下游靶基因,参与调节垂体腺瘤的发生与发展[24]。研究认为hsa_circ_0043459(circ-ERBB2)在同样是腺体肿瘤的乳腺癌组织中高表达,并且可能通过调控下游的miRNA与乳腺癌的进展相关[25]。作为与垂体腺瘤的增殖密切相关的EGFR相关信号通路[26],也是hsa_circ_0043459的调控靶点之一。综合以上,可以推测hsa_circ_0043459很有可能与垂体腺瘤的复发存在相关性。

本研究通过检测垂体腺瘤组织与正常脑组织中的hsa_circ_0043459的表达,实时荧光定量PCR检测结果显示hsa_circ_0043459在垂体腺瘤组织中的表达水平较正常脑组织中的表达升高,表明hsa_circ_0043459可能与垂体腺瘤的生长增殖相关。在复发和未复发垂体腺瘤进一步的比对分析中显示,复发垂体腺瘤中hsa_circ_0043459的表达水平高于未复发组。这提示hsa_circ_0043459的高表达可能与垂体腺瘤的复发有关。为此,该研究进一步将垂体腺瘤组织按照hsa_circ_0043459的平均表达水平分为高表达组和低表达组,通过比较两组的复发率,发现hsa_circ_0043459高表达的垂体腺瘤更容易复发。为明确hsa_circ_0043459是否影响垂体腺瘤复发时间,该研究采用Kaplan-Meier生存曲线方法分析认为,hsa_circ_0043459高表达的垂体腺瘤患者平均复发时间更短。为了进一步分析在多种因素相互作用下,hsa_circ_0043459表达与垂体腺瘤复发的关系,该研究采用多因素logistic回归分析检验方法显示hsa_circ_0043459的表达、肿瘤侵袭和肿瘤切除程度是垂体腺瘤术后复发的相关风险因素。但对于在垂体腺瘤中hsa_circ_0043459如何通过调控相关靶点分子的具体机制,还有待进一步研究。

综上所述,hsa_circ_0043459的高表达是垂体腺瘤复发的风险因素之一。通过进一步的研究,hsa_circ_0043459或许可以作为垂体腺瘤复发的一个重要预测或干预靶点。