决明子多糖调节IL-6/JAK2/STAT3通路对高糖诱导视网膜神经节细胞损伤的影响

曹平 苏露煜

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一,也是导致视力损伤和失明的主要原因[1]。视网膜神经节细胞是位于视网膜内表面附近的一种神经元细胞,其为视神经的重要组成部分,高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤是DR发生的重要原因[2]。因此,深入研究高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤机制对治疗DR有重要意义。决明子具有清肝明目、润肠通便的疗效,决明子多糖是其主要有效成分之一,具有良好的抗氧化、抗菌、明目、降血糖血脂和增强机体免疫力等作用[3]。有研究证实,决明子多糖可以对青光眼所致视网膜细胞损伤有保护作用[4]。细胞白介素-6(interleukin 6,IL-6)/Janus激酶2(Janus kinase-2,JAK2)/信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路参与了机体血管生成、免疫调节、细胞增殖分化等多种生理病理过程,与多种疾病的发生发展密切相关[5,6]。有研究表明,盐酸青藤碱可通过抑制IL-6/JAK2/STAT3级联反应来抑制浆细胞性乳腺炎的进展[7]。但笔者发现决明子多糖通过调节IL-6/JAK2/STAT3通路对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的影响尚不清楚。因此,本研究旨在探讨决明子多糖调节IL-6/JAK2/STAT3信号通路对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人视网膜神经节细胞株RGC-5购自美国标准生物品收藏中心。

1.2 主要试剂 决明子多糖(货号：HY-DZ4122)购自安徽华远经济发展有限公司;JAK2/STAT3的激活剂colivelin(货号：30124568)购自深圳海思安生物技术有限公司;丙二醛(MDA)ELISA试剂盒(货号：BC0025)、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒(货号：BC0175)、谷氨酸(Glu)ELISA试剂盒(货号：BC1585)购于北京索莱宝科技有限公司;兔源一抗IL-6(货号：ab233706)、p-JAK2(货号：ab195055)、JAK2(货号：ab39636)、p-STAT3(货号：ab30647)、STAT3(货号：119352)、增殖细胞核抗原(PCNA)(货号：ab265585)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)(货号：ab4051)、自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ(货号：ab48394)、LC3Ⅰ(货号：ab244816)、Beclin-1(货号：ab217179)以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(货号：ab288151)均购自美国Abcam公司。

1.3 细胞培养 将RGC-5细胞置于含10%胎牛血清、100 U/ml青-链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5% CO2的稳定环境下常规培养,定期观察,每1～2天更换1次培养基,当细胞融合度>85%时,消化传代,收集对数期的细胞进行实验。

1.4 高糖诱导及分组 将处于对数期的RGC-5细胞分为对照组(正常培养)、高糖组[8](50 mmol/L葡萄糖处理细胞)、决明子多糖低剂量组[4](50 mmol/L葡萄糖+15 mg/L的决明子多糖)、决明子多糖高剂量组[4](50 mmol/L葡萄糖+60 mg/L的决明子多糖)、激活剂组[9](50 mmol/L葡萄糖+60 mg/L的决明子多糖+0.5 μmol/L JAK2/STAT3的激活剂colivelin)、激活剂对照组(50 mmol/L葡萄糖+0.5 μmol/L JAK2/STAT3的激活剂colivelin)。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖 各组细胞以1×104个/孔接种到96孔板中。分别将细胞培养24、48、72 h后,弃去细胞上清液,且在指定的时间点向每个孔中加入含有10 μl CCK-8溶液的100 μl完全培养基。孵育2 h后,使用酶标仪检测吸光度。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集各组RGC-5细胞,以预冷的PBS洗涤2次,添加100 μl结合缓冲液悬浮各组RGC-5细胞,再分别添加Annexin V-FITC和PI染液5 μl,充分混匀,与室温下避光染色15 min,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 ELISA检测细胞上清液中MDA水平、SOD活性和Glu含量 收集各组细胞上清液,分别参照MDA、SOD、Glu的ELISA试剂盒说明书检测MDA水平、SOD活性和Glu含量。

1.8 Western blot检测相关蛋白表达 RIPA裂解缓冲液提取RGC-5细胞总蛋白,电泳分离蛋白,100 V恒压转移蛋白至PVDF膜上,用5%的脱脂牛奶封闭2 h,将膜与一抗IL-6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、PCNA、caspase-3、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、GAPDH,4℃孵育过夜,再将膜与HRP偶联的羊抗兔二抗在室温下孵育2 h,弃去液体,洗涤3次,加入ECL试剂观察蛋白质印迹,Image J软件评估蛋白的灰度值。

2 结果

2.1 6组RGC-5细胞增殖能力比较 与对照组比较,高糖组RGC-5细胞的OD450值降低(P<0.05);与高糖组比较,决明子多糖低剂量组、决明子多糖高剂量组RGC-5细胞的OD450值升高(P<0.05);与决明子多糖高剂量组比较,激活剂组RGC-5细胞的OD450值降低(P<0.05),与高糖组比较,激活剂对照组RGC-5细胞的OD450值降低(P<0.05)。见表1。

表1 6组RGC-5细胞OD450值比较 n=6,

2.2 6组细胞凋亡情况比较 与对照组比较,高糖组RGC-5细胞凋亡率升高(P<0.05);与高糖组比较,决明子多糖低剂量组、决明子多糖高剂量组RGC-5细胞凋亡率降低(P<0.05);与决明子多糖高剂量组比较,激活剂组RGC-5细胞凋亡率升高(P<0.05);与高糖组比较,激活剂对照组RGC-5细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表2,图1。

图1 6组RGC-5细胞凋亡情况

表2 6组 RGC-5细胞凋亡率比较 n=6,%,

2.3 6组RGC-5细胞上清液中MDA水平、SOD活性和Glu含量比较 与对照组比较,高糖组RGC-5细胞的MDA水平和Glu含量明显升高,SOD活性下降(P<0.05);与高糖组比较,决明子多糖低剂量组、决明子多糖高剂量组RGC-5细胞的MDA水平和Glu含量降低,SOD活性升高(P<0.05);与决明子多糖高剂量组比较,激活剂组RGC-5细胞的MDA水平和Glu含量升高,SOD活性下降(P<0.05),与高糖组比较,激活剂对照组RGC-5细胞的MDA水平和Glu含量升高,SOD活性下降(P<0.05)。见表3。

表3 6组RGC-5细胞上清液中MDA水平、SOD活性和Glu含量比较 n=6,

2.4 6组细胞中增殖、凋亡和IL-6/JAK2/STAT3通路相关蛋白表达比较 与对照组比较,高糖组RGC-5细胞的PCNA表达水平明显降低(P<0.05),IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表达显著升高(P<0.05);与高糖组比较,决明子多糖低剂量组、决明子多糖高剂量组RGC-5细胞的PCNA表达水平明显升高(P<0.05),IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表达显著降低(P<0.05);与决明子多糖高剂量组比较,激活剂组RGC-5细胞的PCNA表达水平明显降低(P<0.05),p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表达明显升高(P<0.05);与高糖组比较,激活剂对照组RGC-5细胞的PCNA表达水平显著降低(P<0.05),p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表达明显升高(P<0.05)。见表4,图2。

图2 Western blot检测RGC-5细胞中增殖、凋亡和IL-6/JAK2/STAT3通路相关蛋白表达;A 对照组;B 高糖组;C 决明子多糖低剂量组;D 决明子多糖高剂量组;E 激活剂组;F 激活剂对照组

表4 6组RGC-5细胞中IL-6/JAK2/STAT3通路相关蛋白表达比较 n=6,

2.5 6组细胞中自噬相关蛋白表达比较 与对照组比较,高糖组RGC-5细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平明显升高(P<0.05);与高糖组比较,决明子多糖低剂量组、决明子多糖高剂量组RGC-5细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平明显降低(P<0.05);与决明子多糖高剂量组比较,激活剂组RGC-5细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平升高(P<0.05),与高糖组比较,激活剂对照组RGC-5细胞的LC3Ⅱ/LC3I、Beclin-1表达水平明显升高(P<0.05)。见图3,表5。

图3 Western blot检测RGC-5细胞中自噬相关蛋白表达;A 对照组;B 高糖组;C 决明子多糖低剂量组;D 决明子多糖高剂量组;E 激活剂组;F 激活剂对照组

表5 6组RGC-5细胞中自噬相关蛋白表达比较 n=6,

3 讨论

DR是一种影响视力甚至致盲的慢性进行性疾病,随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变,DR的发生率呈现上升趋势[10]。DR患者早期无明显症状,随着病情的发展,患者会出现视野模糊、缺失、视力下降甚至失明等症状,但目前对DR还没有非常有效的治疗手段[11]。因此,积极探索新的药物靶点以期为DR的防治提供理论参考依据。高糖条件下,视网膜神经节内的SOD活性降低,聚集的活性氧可以将脂质过氧化,产生大量的MDA,造成氧化损伤[12]。本研究用50 mmol/L葡萄糖处理RGC-5细胞,结果表明细胞OD450值、SOD活性降低,细胞凋亡率、MDA水平上升,提示高糖诱导可抑制RGC-5细胞增殖,促进其凋亡,造成其氧化应激损伤。LC3和Beclin-1是自噬标志蛋白,LC3在自噬形成过程中由LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ,Beclin-1与自噬体形成有关[13]。Glu是视网膜内神经细胞的兴奋性递质,Glu释放量过量会导致兴奋性毒性作用[14]。本研究发现,与对照组比较,高糖组RGC-5细胞的Glu含量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达上升,提示高糖可导致视网膜神经节细胞产生自噬。

DR在中医学角度上称为“消渴目病”,属于“视瞻昏渺”、“血灌瞳神”、“云雾移晴”、“暴盲”等内障眼病范畴,其主要病机是虚火上炎,灼伤目中血络;或阴虚日久,目失所养;或气不摄血,血不循经,水液外渗;或气虚行血乏力,目中淤血阻络,阴虚血行滞涩;消渴日久,累及肝肾,目失濡养,由“气阴两虚”进展为“肝肾阴虚”,最终导致“阴阳两虚”,根据患者临床表征进行辩证论治[15]。中医学中采用针灸疗法、穴位按摩、穴位注射疗法、中药热敷疗法等技术治疗DR,同时进行方药治疗,其主要有活血化瘀方、补阳还五汤等复方汤剂治疗,复方丹参滴丸、双丹明目胶囊等中成药治疗,金银花、芒柄花黄素等单味中药治疗以及中西医结合治疗等,在DR的临床治疗中发挥重要作用[16]。中药具有多层次,多靶点,毒副作用小等优点,决明子多糖是从天然植物决明子果实中提取出来的一种多糖混合物,具有重要的药理作用[17]。有研究表明,一定浓度范围的决明子多糖提取物可以增加下游蛋白血红素加氧酶的表达,抑制活性氧的产生,从而保护人视网膜内皮细胞免受高血糖引起的氧化损伤[18]。本研究发现,决明子多糖可提高高糖诱导的RGC-5细胞的OD450值、SOD活性、PCNA表达,并且降低细胞凋亡率、MDA水平、Glu含量、caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达,提示决明子多糖可增强高糖诱导的RGC-5细胞的增殖能力,抑制其凋亡、氧化应激反应和自噬。

IL-6是功能广泛的细胞因子,其参与了炎性反应、细胞分化及增殖等生理病理过程,胞内JAK2通过IL-6特异性受体与FERM结构域相结合并被磷酸化激活,进一步促进STAT3磷酸化,IL-6/JAK2/STAT3通路调控炎性、增殖、凋亡等多种生物学行为[19]。相关研究表明,补肾化痰方可通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路改善去势大鼠股丢失[20];染料木黄铜通过类风湿性关节炎中的JAK2/STAT3途径抑制IL-6诱导的血管内皮生长因子表达和血管生成[21];葛根芩连煎剂通过抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路来缓解小鼠溃疡性结肠炎[22]。本研究发现,与对照组比较,高糖组RGC-5细胞中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达明显升高,提示IL-6/JAK2/STAT3通路可能参与了高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤。与高糖组比较,决明子多糖低、高剂量组RGC-5细胞中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达明显降低,推测决明子多糖可能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路抑制高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤。为了验证该推测,本研究利用JAK2/STAT3的激活剂colivelin进行干预,结果发现,与高糖组比较,激活剂对照组RGC-5细胞中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达明显升高,细胞OD450值、SOD活性、PCNA表达明显降低,细胞凋亡率、MDA水平、Glu含量、caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达显著升高,表明激活IL-6/JAK2/STAT3通路可加剧高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤。最后还发现,colivelin可减弱决明子多糖对高糖诱导的RGC-5细胞损伤的抑制作用。证实了决明子多糖确实可能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路抑制高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤。

综上所述,决明子多糖可通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路对高糖诱导的视网膜神经节细胞起到保护作用,为开发新的治疗DR的药物提供了理论基础。