紫苏提取物的挥发性成分及抑菌活性研究

周潇 李康银 李佳 高伟 杨玉森 李祥睿 李井敏 王远丽

摘要 紫蘇为我国药食同源植物及重要芳香经济作物，利用潜力巨大。为研究紫苏提取物的挥发性成分及抑菌活性，本研究以新鲜紫苏不同植物学部位（叶、籽）为原料，采用不同极性的溶剂浸提浓缩制备得到提取物，用气相色谱-质谱联用方法（GC-MS）分析各组分的挥发性成分，使用滤纸片琼脂扩散法和二倍微量稀释法评估不同提取物的抑菌效果。结果表明：紫苏各提取组分中共鉴定出55种化合物，紫苏叶无水乙醇提取物32种、正丁醇提取物20种、乙酸乙酯提取物29种、石油醚提取物19种，紫苏籽无水乙醇提取物11种、乙酸乙酯提取物7种；紫苏叶无水乙醇提取物对金黄色葡萄球菌表现出较强抑菌效果，MIC 16 mg/mL，MBC 16 mg/mL；紫苏叶乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌具有中等强度的抑菌效果，MIC 64 mg/mL，MBC 128 mg/mL，对大肠杆菌有较弱的抑菌效果，MIC 256 mg/mL，MBC 256 mg/mL，其余提取物组分具有不同程度的抑菌效果。因此，紫苏不同的植物学部位及提取溶剂极性不同，获得提取物的挥发性成分数量、相对含量及种类均存在差异，各提取组分对革兰氏阳性菌和阴性菌表现出不同程度的抑菌作用。该研究旨在对芳香植物紫苏的进一步研究、开发利用提供依据。

关键词 紫苏；植物学部位；极性溶剂；挥发性成分；抑菌活性

中图分类号 R284. 1   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）09-0038-07

Abstract Perilla frutescens is an important "medicinal and edible homologous" plant and an important aromatic cash crop in China. It has great potential for utilization. The volatile components and antibacterial activities of its extracts were studied. In this study， different botanical parts （leaves and seeds） of fresh Perilla frutescens were used as raw materials， and the extracts were prepared by solvent extraction with different polarity and concentration， The volatile components of each component were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The bacteriostatic effects of different extracts were evaluated by filter paper agar diffusion method and double microdilution method. The results showed that 55 compounds were identified from the extracted components of Perilla frutescens， including 32 kinds of absolute ethanol extract， 20 kinds of n-butanol extract， 29 kinds of ethyl acetate extract， 19 kinds of petroleum ether extract from perilla leaves; 11 kinds of absolute ethanol extract and 7 kinds of ethyl acetate extract from perilla seeds; The absolute ethanol extract of perilla leaves showed strong antibacterial effect on Staphylococcus aureus， MIC 16 mg/mL， MBC 16 mg/mL; The ethyl acetate extract of perilla leaves had moderate antibacterial effect on Staphylococcus aureus， MIC 64 mg/mL， MBC 128 mg/ml， and weak antibacterial effect on Escherichia coli， MIC 256 mg/mL， MBC 256 mg/mL; The other extract components have different degrees of antibacterial effects. The above results show that different botanical parts of Perilla frutescens and the polarity of extraction solvent are different， and the quantity， relative content and types of volatile components obtained from the extracts are different. Each component shows different degrees of antibacterial effect on Gram-positive and Gram-negative bacteria. This study aims to provide basis for further research， development and utilization of the aromatic plant Perilla frutescens.

Keywords Perilla frutescens; botanical parts; polar solvent; volatile components; bacteriostatic activity

紫苏[Perilla frutescens（L.）Britt]，又名引子、苏子、白苏、苏麻、香苏、苏草及桂芢等，唇形科紫苏属一年生草本植物。紫苏既是药食同源植物，也是我国重要的芳香经济作物[1-2]。据《中国药典》记载，紫苏叶具有解表散寒、行气和胃之功效，可用于治疗风寒感冒、咳嗽呕恶、妊娠呕吐、鱼蟹中毒等[3-5]。

紫苏起源于我国长江中下游流域，中国、韩国及缅甸地区为紫苏遗传多样性保持较丰富的区域，在我国主要集中分布在云南、甘肃、四川和贵州等地区[6-8]。紫苏叶中挥发性成分为单萜类、倍半萜类、苯丙素类和呋喃酮类物质，挥发性成分具有抗氧化、抗癌、消炎、抑菌、镇静、抗抑郁、止呕、解热、舒张血管等功效[9]。李慧琳等[10]采用水蒸气蒸馏法，分析了贵州不同香型紫苏挥发油成分；王健等[11]采用同时蒸馏萃取法提取紫苏不同部位精油，进一步研究体外抗氧化活性；王晴艺和金荷仙[12]发现紫苏植株香气可以使人精神放松并减少消极情绪；袁康等[13]研究了紫苏精油对稻谷中灰绿曲霉的最小抑制浓度和最小杀菌浓度；袁莲莲等[14]研究了紫苏乙醇粗提取物对烟蚜的生物控制作用；朱双全[15]对紫苏化学成分及药理学研究进展进行了综述。目前，对芳香植物紫苏不同植物学部位，采用不同极性的溶剂浸提浓缩制备得到提取物进一步分析其挥发性成分和抑菌活性等研究鲜见报道。为此，本研究以新鲜紫苏的叶、籽为原料，采用极性大小不同的溶剂进行提取，气相色谱-质谱联用方法（GC-MS）分析提取物的挥发性成分并进一步考察不同极性溶剂的提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阳性菌和阴性菌的抑菌活性，旨在改善目前紫蘇利用过程中科技附加值及竞争力低等问题，同时为紫苏及提取物作为载体的功能性日化产品、保健食品开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏叶、籽为市售新鲜样品，经王远丽副教授鉴定为紫苏［Perilla frutescens （Linn.） Britt.］；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC25923）、大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC25922）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）购自北京保藏生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限公司；吐温80、二氯甲烷、无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚（分析纯），购自四川西陇科学有限公司；无水硫酸钠（分析纯），购自成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

R-220SE旋转蒸发仪（瑞士Büchi公司）；BG-50隔水式培养箱（上海博迅）；GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅）；KT-60A上下立式摇床（中贝仪器）；ZL220.4电子天平，（感量0.000 1 g）（上海赞维）；7890B/5977A气质联用仪（美国Agilent公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 紫苏提取物的制备。新鲜紫苏的叶、籽，剔除异物及病变部分，叶切段（长1～3 cm），使用无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚4种极性溶剂，按固液质量比为1∶12浸提12 h，期间人工间歇式搅拌，提取后固渣弃之，提取液使用旋转蒸发仪在55 ℃及100 mbar条件下减压浓缩，分别获得紫苏叶无水乙醇提取物（A2）、正丁醇提取物（A3）、乙酸乙酯提取物（A4）、石油醚提取物（A5）；紫苏籽使用无水乙醇、乙酸乙酯2种极性溶剂，以同样处理方式制备得到紫苏籽无水乙醇提取物（B1）和乙酸乙酯提取物（B2）。无水硫酸钠对各组分脱水干燥后，各取0.1 g使用二氯甲烷定容至10 mL容量瓶中，超声混匀，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，供GC-MS分析用[16]。

1.3.2 GC-MS条件。色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃。程序升温：初始温度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。载气为氦气，流速1.0 mL/min。进样方式为分流进样，分流比为10∶1，进样体积为1 μL。离子源为EI，电离能70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度260 ℃。检测模式为全离子扫描监测，质量扫描范围：33～550 amu，溶剂延迟3.5 min。根据NIST11谱库检索，取正、反匹配度≥800的鉴定结果，以面积归一化法计算挥发油各组分的相对含量。

1.3.3 菌悬液制备。冰箱中取出菌株，无菌操作下将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC25923）、大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC25922）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）接种于LB琼脂培养基平板上，37 ℃培养24 h 条件下连续活化2次后，挑取少量菌落用无菌生理盐水制成菌体浓度为1×107 cfu/mL的菌悬液待用[16]。

1.3.4 紫苏提取物的抑菌活性。利用滤纸片琼脂扩散法测定抑菌圈直径（Diameter of inhibition zone，DIZ），分别吸取浓度约1×107 cfu/mL的4种细菌菌悬液各100 μL，在肉汤培养基LB固体平板上均匀涂布，并放置无菌滤纸片（直径6 mm），分别滴加10 μL紫苏叶提取物组分（A2～A5）及紫苏籽提取物组分（B1～B2），以10 μg/disc氨苄青霉素为阳性对照，以滴加10 μL无菌水的无菌滤纸片为阴性对照；37 ℃条件下倒置培养24 h，记录抑菌圈直径。上述每个样品重复3次，取平均值[17-18]。

采用2倍微量稀释法测定紫苏叶提取物组分（A2～A5）和紫苏籽提取物组分（B1～B2）的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）与最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。96孔板中依次加入紫苏叶提取物组分（A2～A5）和紫苏籽提取物组分（B1～B2），使其样品浓度梯度为512.00、256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL（含2%的吐温80），然后每孔依次加入浓度约1×107 cfu/mL的各菌悬液100 μL，每个梯度重复3次，2%吐温80溶液为阴性对照，氨苄青霉素为阳性对照，体系置于37 ℃条件培养24 h后，若培养孔内无浑浊，则判断该样品的浓度为MIC。从无菌生长的孔中吸取100 μL溶液接种于LB固体平板上，涂布均匀，37 ℃恒温培养箱中孵育24 h，完全无菌落生长的最低浓度为MBC[17-18]。

2 结果与分析

2.1 紫苏各组分的挥发性成分

按照1.3.2的分析方法对紫苏叶无水乙醇提取物（A2）、正丁醇提取物（A3）、乙酸乙酯提取物（A4）、石油醚提取物（A5）；紫苏籽无水乙醇提取物B1和乙酸乙酯提取物B2组分进行GC-MS分析，共检索出55种化合物，其总离子流见图1，分析结果见表1。

由图1和表1得出，紫苏叶无水乙醇提取物（A2）共检测出32种挥发性香气成分，总相对含量为97.64%；其中，挥发性成分中特有成分10种，分别为1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）环己醇乙酸酯、（4-丙-1-烯-2-基环己基）甲醇、1-乙烯基-1-甲基-4-丙-2-亚基-2-丙-1-烯-2-基环己烷、3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯、甲基（6E，9E，12E，15E）-6，9，12，15-二十二四烯酸酯、甘油亞麻酸酯、2-单棕榈酸甘油、（9Z，12Z）-9，12-十八碳二烯酸2，3-二羟基丙基酯、亚麻酸、乌宋酸甲酯。

紫苏叶正丁醇提取物（A3）共检测出20种挥发性香气成分，总相对含量为94.38%；其中挥发性成分中特有成分6种，分别为异丁酸丁酯、丁酸异丁酯、丁酸丁酯、1-丁氧基-1-异丁氧基丁烷、9，12，15-十八碳三烯酸甲酯、2-十八烯酸单甘油酯。

紫苏叶乙酸乙酯提取物（A4）共检测出29种挥发性香气成分，总相对含量为98.90%；其中挥发性成分中特有成分9种，分别为乙酸丁酯、苯甲醛、2-亚乙基-6-甲基庚-3，5-二烯醛、香茅醇、顺式-柠檬醛、7-（甲基乙亚基）-双环[4.1.0]庚烷、4-（1-甲基乙烯基）-1-环己烯-1-甲醇乙酸酯、毕澄茄烯、反式橙花醇。

紫苏叶石油醚提取物（A5）共检测出19种挥发性香气成分，总相对含量为98.64%；其中挥发性成分中特有成分2种，分别为十二烷和丁香酚。

紫苏籽无水乙醇提取物（B1）共检测出11种挥发性香气成分，总相对含量为98.59%；挥发性成分中特有成分为甘油亚麻酸酯；紫苏籽乙酸乙酯提取物（B2）共检测出7种挥发性香气成分，总相对含量为95.47%。

2.2 紫苏各组分的抑菌活性

按照1.3.4的分析方法对紫苏叶无水乙醇提取物（A2）、正丁醇提取物（A3）、乙酸乙酯提取物（A4）、石油醚提取物（A5）；紫苏籽无水乙醇提取物（B1）和乙酸乙酯提取物（B2）组分进行DIZ检测，结果见图2。

由图2得出，紫苏叶无水乙醇提取物（A2）对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌效果；紫苏叶正丁醇提取物（A3）对大肠杆菌具有抑菌效果；紫苏叶乙酸乙酯提取物（A4）对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有抑菌效果；紫苏叶石油醚提取物（A5）对枯草芽孢杆菌具有抑菌效果；紫苏籽无水乙醇提取物（B1）对供试菌株均无抑菌效果；紫苏籽乙酸乙酯提取物（B2）对枯草芽孢杆菌具有抑菌效果。

2.3 紫苏各组分的MIC及MBC检测

按照1.3.4的分析方法对供试菌株具有抑菌作用的提取物组分，进一步进行MIC及MBC检测，结果见表2。

3 结论

将新鲜的紫苏叶、籽采用不同极性的溶剂进行浸提并进一步减压浓缩制备得到各提取物组分，利用气相色谱-质谱联用方法（GC-MS）进行各组分的挥发性成分分析，共检测出55种化合物，其中紫苏叶无水乙醇提取物检测出32种、正丁醇提取物检测出20种、乙酸乙酯提取物检测出29种、石油醚提取物检测出19种；紫苏籽无水乙醇提取物（B1）检测出11种、乙酸乙酯提取物（B2）检测出7种。

紫苏不同的植物学部位及提取溶剂极性不同，获得的提取物挥发性成分的数量、相对含量及种类均存在差异；紫苏叶提取物和紫苏籽的提取物，挥发性化合物差异较大，相同溶剂提取时，紫苏籽提取物较紫苏叶提取物挥发性强的小分子物质较少，主要集中在挥发性较弱的大分子物质。各提取物组分中，检测出共有化合物2种，分别为（-）-反式石竹烯、（Z，E）-α-法尼烯；紫苏叶各提取物组分中均检测出反-薄荷烯醇、紫苏醛、紫苏醇、α-广藿香烯、叶绿醇-1和叶绿醇-2，但在紫苏籽提取物中未被发现；而紫苏籽提取物中检测出的2-己酰基呋喃、角鲨烯、3，4-二氢-2，7，8-三甲基-2-（4，8，12-三甲基十三烷）-2H-1-苯并吡喃-6-醇在紫苏叶提取物中未被检测出。

紫苏各提取物组分对革兰氏阳性菌和阴性菌表现出不同程度的抑菌作用。紫苏叶无水乙醇提取物（A2）金黄色葡萄球菌DIZ检测中表现出较强抑菌效果，进一步检测MIC为16 mg/mL，MBC为16 mg/mL；紫苏叶正丁醇提取物（A3）对大肠杆菌具有中等强度的抑菌效果，MIC为128 mg/mL，MBC为128 mg/mL；紫苏叶乙酸乙酯提取物（A4）金黄色葡萄球菌具有中等强度的抑菌效果，MIC为64 mg/mL，MBC为128 mg/mL，对大肠杆菌的同样具有较弱的抑菌效果，MIC为256 mg/mL，MBC为256 mg/mL；紫苏叶石油醚提取物（A5）对枯草芽孢杆菌具有较弱的抑菌效果，MIC为256 mg/mL，MBC为256 mg/mL；紫苏籽乙酸乙酯提取物（B2）对枯草芽孢杆菌具有较弱的抑菌效果，MIC为128 mg/mL，MBC为256 mg/mL。

目前，我国对紫苏资源的利用还不够充分，产业化进程还不够完善，对紫苏的利用大多以简单食用为主或直接进行原料低价销售，未形成高附加值的功能型产品研发—生产—销售完整的产业链。因此，亟待对紫苏进行不同提取技术及工艺系统性的研究，以满足当前我国功能性食品及增香增色、防腐抗菌等日化品的开发需求。本研究为紫苏及提取物为载体的产品设计与开发提供了理论基础。

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（责编：何 艳）

基金项目 云南省教育厅科学研究基金项目资助（2022J1607）；玉溪农业职业技术学院药食同源产品研发中心（2021YZ05）。

作者简介 周潇（1987—），男，硕士，工程师。研究方向：植物提取技术及工艺、植物保护、烟用及日化香精香料应用。