基于生物信息学及分子对接研究天牛止眩胶囊治疗原发性高血压的潜在活性成分及分子机制

蔡子杰 姚昆鹏 蔡虎志 陈新宇

[摘要] 目的 利用生物信息学及分子对接，探讨天牛止眩胶囊治疗原发性高血压（essential hypertension，EH）的潜在活性成分及分子机制。方法 利用中药系统药理学数据库和分析平台、BATMAN-TCM平台筛选天牛止眩胶囊的活性成分及药物靶点，使用GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank检索EH的疾病相关靶点，采用Cytoscape3.8.0软件构建“药物–成分–靶点”网络图，应用STRING平台进行蛋白质–蛋白质相互作用分析，使用R软件包进行基因本体论（gene ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，运用AutoDockTools及AutoDock Vina进行分子对接验证，使用PyMol软件进行可视化分析。结果 共筛选出天牛止眩胶囊有效成分53种，涉及相关靶点基因422个。筛选出关键活性化合物217个，拓扑分析得出核心靶点蛋白AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN等10个，GO及KEGG富集分析结果提示天牛止眩胶囊干预EH主要涉及细胞对外的刺激、对活性氧的反应、氧化应激反应等多种生物学途径与涉及脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化等相关通路。分子對接结果显示FOS与槲皮素及山柰酚结合力最强。结论 天牛止眩胶囊中的槲皮素、山柰酚等多种关键活性成分可作用于FOS、JUN、AKT等多个核心靶点蛋白，发挥调控血压、降低心脑血管并发症危险等级、保护靶器官的作用。

[关键词] 天牛止眩胶囊；原发性高血压；生物信息学；分子对接；分子机制

[中图分类号] R255.3；R256.2      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.009

The potential active ingredients and molecular mechanism of Tianniu Zhixuan capsule in treatment of essential hypertension based on bioinformatics and molecular docking

CAI Zijie1， YAO Kunpeng1， CAI Huzhi2， CHEN Xinyu1，2

1.Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， Hunan， China; 2.Department of Cardiovascular Medicine， the First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， Hunan， China

[Abstract] Objective The potential active ingredients and molecular mechanism of Tianniu Zhixuan capsule in treating essential hypertension （EH） were studied based on bioinformatics and molecular docking. Methods Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform and BATMAN-TCM datebase were used to screen active ingredients and drug targets of Tianniu Zhixuan capsule. GeneCards， PharmGkb， TTD and DrugBank were used to search disease-related targets of EH. The “drug-composition-target” network map was constructed using Cytoscape3.8.0 software. STRING platform was used for protein-protein interaction analysis， R software package was used for gene ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis， AutoDockTools and AutoDock Vina were used for molecular docking verification， PyMol software was used for visual analysis. Results A total of 53 effective ingredients of Tianniu Zhixuan capsule were screened， involving 422 related target genes. A total of 217 key active compounds were screened， and 10 core target proteins were identified by topological analysis， including AKT1， MAPK8， NFKB1， FOS， MAPK1， JUN， etc. GO and KEGG enrichment analysis indicated that the intervention of Tianniu Zhixuan capsule in EH mainly involved various biological pathways such as external cell stimulation， response to activated oxygen， oxidative stress and other biological pathways， as well as lipid and atherosclerosis， fluid shear stress and atherosclerosis and other related pathways. Molecular docking results showed that FOS had the strongest binding force with quercetin and kaempferol. Conclusion Quercetin， kaempferol and other key active ingredients in Tianniu Zhixuan capsule can act on FOS， JUN， AKT and other core target proteins， and play a role in regulating blood pressure， reducing the risk level of cardiovascular and cerebrovascular complications and protecting target organs.

[Key words] Tianniu Zhixuan capsule; Essential hypertension; Bioinformatics; Molecular docking; Molecular mechanism

当前，高血压仍是全球疾病负担较重的疾病之一，也是我国面临的重要公共卫生问题之一[1-2]。由于经济及社会医疗资源分配的不均衡，中国高血压人群的血压控制不甚理想。中医药对控制血压、保护靶器官、提高患者远期生存率、延缓心脑血管疾病进展具有重要意义[3]。湖南中医药大学第一附属医院自制天牛止眩胶囊（原名血压平胶囊）用于治疗原发性高血压（essential hypertension，EH），可降低血压，逆转血管重塑，保护靶器官，改善心室重构和胰岛素抵抗，延缓左心室肥厚[4-6]。本文旨在利用生物信息学技术及分子对接方法，探讨天牛止眩胶囊治疗EH的作用机制，为后续课题组的进一步验证提供思路。

1  材料与方法

1.1  有效成分筛选及作用靶标预测

天牛止眩胶囊由汉防己、牛膝、菊花、酸枣仁、天麻组成。在中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）检索汉防己、牛膝、菊花、酸枣仁的有效成分及相应靶点，筛选条件：生物利用度≥30%和类药性≥0.18；在BATMAN-TCM平台检索天麻的有效成分及相应靶点，筛选条件：校正P<0.05及分数截断值≥30。使用UniProt数据库标准化天牛止眩胶囊有效成分靶点。

1.2  疾病靶点的收集

使用“essential hypertension”作为关键词，检索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库，获得EH的疾病靶点基因。筛选并合并上述基因库中与EH相关基因，剔除重复基因。

1.3  药物-疾病核心作用基因筛选

将天牛止眩胶囊的药物靶点基因与EH疾病靶点基因映射，并绘制韦恩圖。借助Cytoscape3.8.0软件，导入药物靶点–疾病靶点映射交集文件，构建“药物–成分–靶点”图。

1.4  靶蛋白相互作用网络构建与拓扑分析

将获得的交集靶基因导入STRING平台，设置物种为人类，最低互动得分≥0.9，获得蛋白质–蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，并删除游离节点。运用Cytoscape3.8.0软件进行可视化分析，使用CytoNCA插件进行拓扑分析，计算各节点度值，获取核心靶点基因。

1.5  富集分析

利用R软件包对交集基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路与基因本体论（gene ontology，GO）富集分析。

1.6  分子对接

选择药物–成分–靶点中排名前2的活性化合物作为小分子配体，在PubChem CID数据库获取有效成分的化学结构，于Uniprot数据库中查询关键靶点信息，在PDB数据库下载核心靶点蛋白结构，利用PyMOL软件移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子。使用AutoDockTools1.5.7软件将晶体结构加氢、加电荷。使用AutoDock Vina软件进行分子对接，计算最低结合能，使用PyMol软件处理和可视化分子对接结果。

2  结果

2.1  活性成分筛选及作用靶标预测

于TCMSP数据库检索得到40种化合物。其中防己3种、牛膝20种、菊花8种、酸枣仁9种。使用BATMAN-TCM平台进行补充，得到天麻相关化合物13种。使用Uniprot数据库标准化转换活性成分及对应靶点，通过匹配并筛选去除重复值，获得422个靶点。

2.2  疾病靶点的收集及药物靶点与疾病靶点交集

检索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库，分别得到EH靶点2781、57、72、112、76个，筛选并去除重复值后得到靶点2872个，见图1。药物靶点与疾病靶点有217个交集，见图2。

2.3  筛选药物-疾病核心作用基因

将天牛止眩胶囊的预测靶点与EH的相关靶点取交集，再导入Cytoscape软件，构建“药物–成分–靶点”网络图，见图3。图中共计256个节点，467条边。天牛止眩胶囊中有效成分槲皮素、山柰酚、棕榈酸、汉黄芩素、β-谷甾醇分别与101、39、33、31、24个靶点相关。PTSG1（18个）是有效成分对应靶点数量最多的基因，其次是PTGS2（17个）、AR（16个）和PGR（16个）。

2.4  PPI网络构建与拓扑分析

将筛选的天牛止眩胶囊与EH的217个共同靶点提交至STRING平台，构建天牛止眩胶囊干预EH的PPI网络，见图4。该PPI网络图中有162个节点，633条边。使用CytoNCA功能进行拓扑分析，对基因相关指标进行筛选，得到13个核心基因。网络拓扑分析显示，核心基因前10位分别为TNF、EGFR、AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、TP53、ESR1、MAPK1、JUN，见图5。

注：右侧黄色代表作用靶点，左侧圆圈代表药物有效成分，淡紫色代表天麻有效成分，淡红色代表酸枣仁有效成分，天蓝色代表牛膝有效成分，墨蓝色代表防己有效成分，深紫色代表菊花有效成分，淡粉色代表防己与牛膝共有有效成分，淡绿色代表菊花与牛膝共有有效成分，深绿色代表天麻与菊花有效成分

2.5  富集分析

将天牛止眩胶囊的217个潜在靶点进行基因富集分析，得到2778个GO富集条目，包括生物过程2440个、细胞组分103种和分子功能235种，得到195条KEGG通路。各选取生物过程、细胞组分、分子功能排名前10的GO条目绘制柱状图，选取KEGG通路前30的条目绘制气泡图，见图6。

A.FOS与槲皮素结合模式图；B.FOS与山柰酚结合模式图；C.JUN与槲皮素结合模式图；D.JUN与山柰酚结合模式图；E.AKT与槲皮素结合模式图；F.AKT与山柰酚结合模式图

2.6  分子对接

选取“药物–成分–靶点”网络中与靶点互动关系密切程度居前的2个活性化合物（槲皮素、山柰酚）作为小分子配体。筛选2次拓扑分析后获得的前10核心靶点蛋白，选择与活性成分有关联的靶点蛋白（AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN），使用AutoDock Vina软件进行分子对接，并计算各个蛋白与小分子配体间的最低结合能，见表1。利用PyMol软件数据库可视化分析对接效果最好的6对分子–靶点模式图，见图7。

3  讨论

根据高血压病的发病症状，中医将EH归为眩晕、头痛等范畴[7]。历代医家多认为“诸风掉眩，皆属于肝”，从肝风、肝阳角度论治高血压病成为主流。其病机为肝阳上亢、痰饮内停、肾阴亏虚，常夹杂发病。多治以平肝潜阳、化痰息风、健脾祛湿、滋补肝肾、养阴填精法[3]。高血压病责之在肝，其次为心、肾。肝体阴而用阳，赖阴血以滋养，故肝阴不足，阳则易亢。另肝主疏泄，司条达，疏泄失常，致肝郁气滞、郁而化热、耗伤阴血，可致肝阴亏虚、肝阳上亢或肝火炽盛。肝藏血，心主血，肝阴血不足，可致心火亢盛，心火亢盛可耗伤肝阴。肾藏精，肝阴亏损，下竭肾阴，水不涵木，肝阳亢盛。天牛止眩胶囊重在治肝，兼顾心、肾，共奏养肝柔肝、平肝潜阳、利尿定眩之效。

前期研究发现，天牛止眩胶囊可通过下调心肌组织Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）2、TLR4、MyD88蛋白的表達，从而抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化，达到降血压、改善高血压所致的靶器官损伤、心室重构等作用[6]。天牛止眩胶囊可改善EH患者的胰岛素抵抗，减少EH患者的危险因素，降低其危险分层[4-5]。现代药理研究显示，天麻素通过一氧化氮（nitric oxide，NO）/可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）/环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）介导的途径参与内皮依赖性舒张[8]。酸枣仁皂苷通过内皮细胞通道增加Ca2+内流诱导内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）激活，并通过打开内皮细胞BKCa和KATP通道诱导超极化降低血管张力、保护内皮功能[9]。菊花的主要提取物黄酮类化合物可调节肠道菌群，抑制肠源性脂多糖/TLR4通路的激活，改善血管内皮功能，起到降压作用[10]。汉防己中所含的粉防己碱可通过抑制HepG2细胞的细胞毒性、活性氧生成和谷胱甘肽耗竭，有效缓解氧化损伤，改善氧化应激[11]。怀牛膝可通过调节表皮生长因子受体和胞外信号调节激酶激活eNOS，增加NO的产生，舒张血管[12]。另外，怀牛膝可下调巨噬细胞中的NF-κB和活化蛋白-1（activating protein-1，AP-1）抑制诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧合酶2、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β表达，发挥抗炎作用[13]。

笔者采用生物信息学技术及分子对接方法，对天牛止眩胶囊治疗EH进行分子机制方面的探讨。初步筛选出天牛止眩胶囊调控EH的主要活性成分为槲皮素、山柰酚。动物研究发现槲皮素可减轻氧化应激反应，舒张血管平滑肌，改善血管内皮功能障碍，起到调节血压的作用[14]。其机制可能与槲皮素可显著抑制NO、iNOS、IL-6、NF-κB的核易位、细胞外信号调节激酶1/2和c-Jun N末端激酶的产生有关[15]。槲皮素还可抑制炎症介质的产生[16]。研究证实山柰酚有利尿和肾脏保护作用；山柰酚可通过NO/cGMP/cGMP依赖性蛋白激酶途径诱导内皮依赖性血管松弛[17]。分子对接结果证实，槲皮素、山柰酚等活性成分能以疏水键、氢键与核心靶点进行对接结合，且结合强度较高。

天牛止眩胶囊调控EH的主要靶点与炎症应答、氧化应激、内皮功能障碍、细胞凋亡、血管重塑等有关，涉及脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、细胞凋亡、松弛素等多条信号通路。研究表明，上述通路广泛参与高血压的氧化应激、炎症反应、免疫介导和血管内皮功能障碍，并与内皮损伤介导的动脉粥样硬化、高血压导致的心室重构及心肌纤维化有关[18-21]。

本研究借助網络药理学方法，分析天牛止眩胶囊调控EH的机制。结果表明天牛止眩胶囊体现多通路、多靶点联合作用调控血压的特点，分子对接方法验证结果符合预期。

[参考文献][1] POULTER N R， PRABHAKARAN D， CAULFIELD M. Hypertension[J]. Lancet， 2015， 386（9995）： 801–812.

[11] WANG L， CI X， LV H， et al. Isotetrandrine ameliorates tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress through upregulation of heme oxygenase-1 expression[J]. Exp Biol Med （Maywood）， 2016， 241（14）： 1568–1576.