circ_0001368靶向miR-616对肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响

黄昱刚 谭伶娟 陈广 郭菁

环状RNA(circular RNA,circRNA)是以共价键形成的一种环状结构的非编码RNA分子,研究表明circRNA在肺癌中表达异常,并可能通过充当微小RNA(miRNA)的海绵分子而调节肺癌细胞生物学行为[1,2]。circ_0001368在肾细胞癌组织和细胞中表达下调,既可阻碍肾癌细胞增殖,又可抑制其侵袭[3]。Circular RNA Interactome证明miR-616和circ_0001368具有结合位点。研究表明miR-616在非小细胞肺癌组织和细胞中表达增加[4]。但上游非编码基因如何调控miR-616表达进而参与肺癌发生发展过程并不清晰。故开展本研究,以评价circ_0001368经靶向调节表达miR-616调控肺癌细胞的可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2019年11月至2020年2月本院收治的47例肺癌患者的肺癌及癌旁组织标本,其中男28例,女19例;年龄53～66岁,平均年龄(58.32±3.26)岁。

1.2 材料与试剂 人肺癌细胞A549购自上海匹拓生物;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、CCK-8试剂(于上海碧云天生物购进);反转录与荧光定量PCR试剂(于大连宝生物工程购进)购自;LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(于美国Invitrogen购进);双荧光素酶报告基因载体及其活性检测试剂盒(于美国Promega购进)购自美国;山羊抗兔IgG二抗、兔抗E-cadherin与N-cadherin抗体(于美国CST购进)。

1.3 方法

1.3.1 本研究细胞转染及分组方式:A549细胞用DMEM培养基(含10%胎牛血清、双抗)和37℃、5% CO2培养箱。采用脂质体转染法进行转染:参照LipofectamineTM3000试剂盒将pcDNA、pcDNA-circ_0001368、anti-miR-NC、anti-miR-616、pcDNA-circ_0001368和miR-NC、pcDNA-circ_0001368和miR-616 mimics转染细胞内,记为 pcDNA组、pcDNA-circ_0001368组、anti-miR-NC组、anti-miR-616组、pcDNA-circ_0001368+miR-NC组、pcDNA-circ_0001368+miR-616组。

1.3.2 基因的表达水平检测:qRT-PCR检测基因的表达水平。将Trizol试剂1 ml加入各组A549细胞、肺癌组织及癌旁组织中,提取总RNA,反转录合成cDNA,按照95℃ 2 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,40循环的扩增条件进行PCR。miR-616、circ_0001368二者的相对表达量以2-ΔΔCt法计算。

1.3.3 细胞增殖检测:细胞增殖以CCK-8实验检测。恰当选取各组A549细胞,取96孔板并接种其上,与10 μl CCK-8溶液反应2 h,450 nm波长处的光密度(OD)值以酶标仪读取。

1.3.4 平板克隆形成实验:对各组A549细胞进行接种及培养,接种14 d后若发现克隆团,则行甲醇固定,固定时间为20 min。然后再以结晶紫染色液(1%)染色,染色时间为15 min,染色完毕后进行拍照,并统计细胞克隆形成数。

1.3.5 划痕实验:于6孔板(1×105个/孔)上接种各组A549细胞,接种完毕后将其置于CO2(体积分数5%)、37℃培养箱内进行培养,待细胞长满后用移液枪(200 μl)枪头与底板相垂直进行划痕,划下的细胞以预冷PBS洗涤,在培养箱内进行24 h培养,然后将6孔板取出,置于显微镜下认真观察,应用ImageJ软件对各组细胞迁移距离进行检测。

1.3.6 细胞侵袭检测:实验细胞侵袭行Transwell检测。将上室以Matrigel基质胶稀释液铺满,接种各组A549细胞,下室加600 μl培养液(含10%胎牛血清)培养48 h,多聚甲醛固定,20 min用结晶紫行15 min染色,侵袭细胞数于显微镜下观察。

1.3.7 靶向关系检测:靶向关系以双荧光素酶报告实验评价。预测显示circ_0001368与miR-616存在结合位点。将circ_0001368与miR-616结合序列与突变序列克隆至pmirGLO载体,成野生型(WT)-circ_0001368载体、突变型(MUT)-circ_0001368载体,再将其分别与miR-616 mimics或miR-NC对A549细胞共转染,转染24 h后,检测A549细胞的相对荧光素酶活性,检测试剂盒为双荧光素酶活性检测试剂盒。

1.3.8 Western blot蛋白表达量检测:蛋白表达量以Western blot检测。各组A549细胞总蛋白以RIPA裂解液提取,以BCA检测其浓度,分离转膜(SDS-PAGE电泳),封闭2 h(5%脱脂牛奶),加E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)一抗与内参GAPDH抗体(1∶3 000)稀释液,4℃孵育24 h,加二抗稀释液(1∶5 000)37℃孵育1 h,滴加ECL后在暗室内显影,以ImageJ软件评价N-cadherin、E-cadherin条带灰度值。

2 结果

2.1 circ_0001368、miR-616于肺癌组织中的表达情况 肺癌组织中circ_0001368的表达量较癌旁组织降低(P<0.05),miR-616的表达量较癌旁组织升高(P<0.05)。见表1。

表1 circ_0001368和miR-616在肺癌组织中的表达

2.2 上调circ_0001368表达对肺癌A549细胞增殖的影响 与pcDNA组比较,pcDNA-circ_0001368组细胞活力降低,细胞克隆形成数减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 上调circ_0001368表达对肺癌A549细胞增殖的影响达

2.3 上调circ_0001368表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响 与pcDNA组比较,pcDNA-circ_0001368组N-cadherin蛋白水平、侵袭细胞数以及划痕愈合率减小(降低),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)。见表3,图1。

图1 上调circ_0001368表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

表3 上调circ_0001368表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响

2.4 circ_0001368靶向调控miR-616的表达 circ_0001368与miR-616存在结合位点。相较于miR-NC组,miR-616组降低WT-circ_0001368荧光素酶活性(P<0.05)。circ_0001368可负向调控miR-616表达(P<0.05)。见图2,表4、5。

图2 circ_0001368序列内存在核苷酸序列与miR-616互补

表4 双荧光素酶报告实验

表5 circ_0001368对miR-616表达的调控

2.5 抑制miR-616表达对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响 相较于anti-miR-NC组,anti-miR-616组N-cadherin蛋白水平、划痕愈合率、细胞活力及侵袭细胞数目与细胞克隆形成数目降低(或减少),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)。见图3,表6。

图3 抑制miR-616表达对肺癌A549细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表6 抑制miR-616表达对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.6 miR-616过表达逆转了上调circ_0001368表达对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用 与pcDNA-circ_0001368+miR-NC组比较,pcDNA-circ_0001368+miR-616组细胞活力、N-cadherin蛋白、细胞克隆形成数目和侵袭细胞数目升高(或增多),划痕愈合率和水平升高,E-cadherin蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表7,图4。

图4 2组E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白及GAPDH水平比较

表7 2组肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭情况比较

3 讨论

circRNA具有组织特异性、高度稳定性等特点,其不易被核酸外切酶降解,主要分为外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA,研究表明circRNA在肺癌中表达上调或下调,还可能作为肺癌治疗的潜在靶点[5-8]。

circ_0001368在胃癌组织和细胞中低表达,敲低其表达可促进胃癌细胞的增殖和侵袭[9]。circ_0001368表达异常在垂体腺瘤发生、进展过程中具有重要作用[10]。本研究肺癌组织中circ_0001368的表达量低于癌旁组织,进一步研究发现circ_0001368过表达可降低肺癌细胞活力,细胞克隆形成数减少。N-cadherin与E-cadherin表达失调可促进肺癌细胞转移,由于N-cadherin与E-cadherin属于上皮-间质转化(EMT)标志物,EMT转化发生时可促进细胞转移[11]。本研究结果显示,circ_0001368过表达可抑制肺癌细胞划痕愈合率和N-cadherin表达,侵袭细胞数减少,而E-cadherin表达上调,提示circ_0001368过表达可抑制肺癌细胞迁移及侵袭。

miR-616在胶质瘤[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]、卵巢癌[15]组织和细胞中表达增加。本研究肺癌组织中miR-616的表达量较癌旁组织显著偏高,上调miR-616表达可降低circ_0001368过表达对肺癌细胞增殖及转移的抑制作用。提示circ_0001368可通过靶向调控miR-616的表达而抑制肺癌细胞增殖及转移从而发挥抑癌基因作用。

综上所述, circ_0001368可通过调控miR-616抑制肺癌细胞增殖、侵袭、克隆、迁移,circ_0001368/miR-616分子轴在肺癌发生发展过程中可能发挥重要调控作用,并可能作为肺癌治疗的潜在靶点。