响应面法优化甘蔗芭蕉复合发酵液的制备工艺

余森艳 何泽 苏秀芳 卢珍兰 李志红 王强

（1. 广西民族师范学院化学与生物工程学院 广西崇左 532200；2. 广西民族师范学院甘蔗产业链协同创新中心 广西崇左 532200）

被誉为“中国糖都”的广西崇左市，是全国甘蔗种植和蔗糖生产的最大基地[1-2]。甘蔗汁多味甜，还富含多酚、黄酮等成分，抗氧化、抗炎症、抗基因变异的作用较强[3-4]。甘蔗是我国糖业的重要组成部分，但其产业链比较单一，且制糖后营养成分会有所损失，若将甘蔗直接用于食品深加工领域将大有可为。芭蕉是热带地区盛产的一种药食兼用的水果，在我国南方大部分地区，如广西、云南、海南等地都有栽培[5]。芭蕉含有多种维生素、糖类以及钙、磷、铁等微量元素，营养价值高[6]，味道清甜爽口，且具有开胃消食等功效。但芭蕉成熟后不耐贮藏运输，鲜销能力有限，深加工目前还比较匮乏。

复合水果发酵液，是以多种鲜果为原料，经过酵母菌、乳酸菌等微生物发酵而成的功能性发酵液[7]。通过益生菌发酵后，水果中的有益成分能保留在产品中，而且水果中所富含的花青素以及多种酶类，如蛋白酶、多酚氧化酶、SOD（超氧化物歧化酶）等[8]，使得发酵液具有抗氧化、抗衰老、抑菌的功效[9]。同时，多种益生菌混合发酵，协同作用，还可以赋予产品独特的风味，提升其保健功能[10]。将甘蔗与芭蕉复合制备成水果发酵液能充分利用我国广西地区甘蔗、芭蕉资源，解决芭蕉不耐贮运的困境，促进当地经济发展，开拓农产品资源利用途径，还能将甘蔗和芭蕉中特有的营养成分和丰富的活性物质通过益生菌发酵来提升其营养价值及功能特性，为新型水果复合发酵液的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗、芭蕉，崇左农贸市场；精幼砂糖，安琪酵母（赤峰）有限公司；柠檬酸（食品级），山东潍坊英轩实业有限公司；VC（食品级），河南万邦实业有限公司；酵母菌（SY 型果酒专用酵母）、乳酸菌（由嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌组合的2 菌型乳酸发酵剂），安琪酵母股份有限公司。

95%乙醇溶液、0.05 mol/L 氢氧化钠溶液、Tris-HCl 缓冲液，飞净生物科技有限公司；0.1 mol/L 盐酸溶液，深圳市铖远科技有限公司；1%酚酞溶液，广西和为医药科技有限公司；DPPH，合肥巴斯夫生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸、过氧化氢，成都市科隆化学品有限公司。

BD-320HEM 冰箱，青岛海尔特种电冰柜有限公司；JYZ-E3C 原汁机，九阳股份有限公司；YP5002 电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；C21-WT2103A 电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司；PAL-1 数显折射计，广州市爱宕科学仪器有限公司；AK002C 数显糖度计，深圳市测友科技有限公司；UV759CRT 紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；LRHS-250-II 恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程① 甘蔗→去皮切块→压榨→过滤→甘蔗原汁；

② 芭蕉→去皮切块→灭酶→护色打浆→芭蕉浆；

1.2.2 操作要点（1）甘蔗原汁的制备 选择汁液较多、无霉变的甘蔗，清洗、去皮、切块，压榨灭菌获得甘蔗原汁，备用。

（2）芭蕉浆的制备 选择新鲜无腐烂，成熟度适中的芭蕉，去皮切块后过沸水热烫2 min 灭酶，按料液比1:3（m:m）比例加入清水，再分别加入0.05%的维生素C 和柠檬酸，混合均匀后打浆，获得芭蕉浆备用。

（3）混合调糖 以1:1（m:m）的比例将甘蔗原汁、芭蕉浆混合均匀，再添加蔗糖调整到适宜的糖度。

（4）杀菌、冷却 灭菌温度为100℃，保持15 min。杀菌后立即冷却至室温。

（5）酵母菌发酵 向混合液中加入果酒专用酵母并搅拌均匀，然后放入恒温培养箱中，调整发酵温度进行发酵，发酵时间为20～28 h。

（6）乳酸菌发酵 待酵母菌发酵结束后，向发酵液中添加乳酸菌并搅拌均匀，在恒温培养箱中进行二次发酵，调整适宜的发酵温度，发酵时间为6～14 h。在发酵期间注意保持温度恒定，以更好地促进发酵液风味物质的形成。

1.2.3 酵母菌发酵单因素试验设计（1）初始糖度对复合发酵液品质的影响 在酵母菌添加量为0.5%（调糖后原料质量比，下同）、发酵温度为30℃、发酵时间为24 h 条件下发酵，探究初始糖度分别为12%、14%、16%、18%、20%对复合发酵液品质的影响，以确定适宜的初始糖度。

（2）酵母菌添加量对复合发酵液品质的影响 在初始糖度为16%、发酵温度为30℃、发酵时间为24 h 条件下发酵，探究酵母菌添加量分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%对复合发酵液品质的影响，以确定酵母菌添加量的适宜范围。

（3）发酵温度对复合发酵液品质的影响 在初始糖度为16%、酵母菌添加量为0.5%、发酵时间为24 h 条件下发酵，探究发酵温度分别为26、28、30、32、34℃对复合发酵液品质的影响，以确定适宜的发酵温度。

（4）发酵时间对复合发酵液品质的影响 在酵母菌添加量为0.5%、初始糖度为16%、发酵温度为30℃条件下发酵，探究发酵时间分别为20、22、24、26、28 h 对复合发酵液品质的影响，以确定发酵时间的适宜范围。

（5）酵母菌发酵复合发酵液的感官评价标准 由10 名食品专业感官评价员（5 名男生和5名女生组成，具有一定的食品感官评价理论基础，下同）对酵母菌发酵阶段甘蔗芭蕉复合发酵液的色泽、香气、口感、组织形态进行感官评定。感官评分标准如表1 所示，感官评价结果取平均值。

表1 酵母菌发酵阶段复合发酵液的感官评价标准

（6）响应面试验设计 在单因素试验设计的基础上，以感官评分（Y）为响应值，初始糖度（A）、酵母菌添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4 个因素进行响应面分析试验，得出最佳工艺组合，并确定甘蔗芭蕉复合发酵液在酵母菌发酵阶段的最佳工艺条件。试验因素水平设计如表2 所示。

表2 响应面试验因素水平设计

1.2.4 乳酸菌发酵单因素试验设计在酵母菌发酵的基础上，加入乳酸菌进行第二次发酵。

（1）乳酸菌添加量对发酵液品质的影响 在发酵温度42℃、发酵时间10 h 条件下发酵，探究乳酸菌添加量分别为2%、2.5%、3%、3.5%、4%对复合发酵液品质的影响，以确定适宜的乳酸菌添加量范围。

（2）发酵时间对发酵液品质的影响 在发酵温度42℃、乳酸菌添加量3%条件下发酵，探究发酵时间分别为6、8、10、12、14 h 对复合发酵液品质的影响，以确定发酵时间的适宜范围。

（3）发酵温度对发酵液品质的影响 在乳酸菌添加量3%、发酵时间10 h 条件下发酵，探究发酵温度分别为40、41、42、43、44℃对复合发酵液品质的影响，以确定适宜的发酵温度。

（4）乳酸菌发酵后复合发酵液的感官评价标准 由10 名食品专业感官评价员对乳酸菌发酵阶段甘蔗芭蕉复合发酵液的色泽、香气、口感、组织形态进行感官评定。感官评分标准如表3 所示，感官评价结果取平均值。

表3 乳酸菌发酵阶段复合发酵液的感官评价标准

（5）正交试验设计 在单因素试验的基础上，通过感官评价的方法，以乳酸菌添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）为考察因素进行正交优化试验，以感官评价标准为评定依据，确定甘蔗芭蕉复合发酵液乳酸菌发酵阶段的最佳工艺，试验因素水平见表4。

表4 正交试验因素水平表

1.2.5 项目测定以最佳配方生产的甘蔗芭蕉复合发酵液为样品，测定其主要理化指标。

（1）pH 使用酸度计测定。

（2）糖度 数显糖度测定仪测定。

（3）可溶性固形物含量（TSS） 用数显折射计测定。

（4）酸度 参照《食品安全国家标准 食品酸度的测定》（GB 5009.239—2016）方法检测。

（5）抗氧化能力的测定[11-12]① DPPH 自由基清除能力的测定，取0.2 mL 试样加入到1.8 mL水中，然后再加入2 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 的乙醇溶液，样品摇匀后在室温下避光反应30 min，利用分光光度计测定517 nm 处的吸光值。发酵前样品代替试样作为自身对照组。重复测定3 次，结果取平均值。DPPH 清除率按照式（1）计算。

式中：Ai为2 mL DPPH 和2 mL 试样混合后在517 nm 处的吸光值；Aj=2 mL 试样和2 mL 乙醇混合后在517 nm 处的吸光值；A0=2 mL DPPH和2 mL 乙醇混合后在517 nm 处的吸光值。

② 羟自由基清除能力的测定，将 1 mL 9 mmol/L FeSO4、1.0 mL 9 mmol/L 水杨酸及1 mL的试样加入到试管中，再加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液启动反应，于37℃下反应30 min，利用分光光度计测定510 nm 处的吸光值。空白样品以蒸馏水替代试样。发酵前样品代替试样作为自身对照组。重复测定3 次，结果取平均值。羟自由基清除率利用式（2）计算。

式中：Ax为试样吸光度；A0为空白对照样品吸光度；Ax0为水替代H2O2的本底吸光度。

③ 超氧阴离子自由基清除能力的测定，取1 mL 试样和0.4 mL 25 mmol/L 邻苯三酚溶液加入到4.5 mL pH 8.2 的Tris-HCl 缓冲液（50 mmol/L）中静置反应25 min，加入1 mL 8 mmol/L 的HCl溶液结束反应，然后利用分光光度计测定样品299 nm 处的吸光度值。发酵前样品代替试样作为自身对照组。重复测定3 次，结果取平均值。超氧阴离子自由基清除率利用式（3）计算。

式中：Ax为试样吸光度；A0为空白对照样品吸光度；Ax0为水替代邻苯三酚的本底吸光度。

1.2.6 数据处理

运用Excel 完成数据整理，SPSS 20.0 软件进行方差分析及显著性差异分析，利用Origin 2019软件完成单因素试验作图，运用Design-Expert 8.0.6软件完成响应面试验作图及数据分析。

2 结果与分析

2.1 酵母菌发酵单因素试验结果与分析

2.1.1 初始糖度对甘蔗芭蕉复合发酵液的影响由图1 可知，随着初始糖度的增加，感官评分先升后降，当初始糖度为16%时，感官评分最高，此时的发酵液酒香协调，口感柔和。初始糖度为12%时，发酵出来的发酵液酒香较淡，口感一般，且甜度低；初始糖度为20%时，所得的发酵液几乎没有酒香，且口感甜腻，可能是由于糖分含量太高，导致复合发酵液的渗透压较大，对发酵过程中的酵母菌生长造成不利影响，甚至使其凋亡[13]，发酵难以进行。因此，选用初始糖度14%、16%、18%进行响应面优化试验。

图1 初始糖度对酵母菌发酵阶段感官评价的影响

2.1.2 酵母菌添加量对甘蔗芭蕉复合发酵液的影响由图2 可知，酵母菌添加量在0.4%、0.5%、0.6%时，感官评分较高，所得的发酵液香气纯正、风味浓郁。菌种添加量为0.3%，发酵液酒香不足，口感平淡，略微甜腻，可能是果酒酵母菌数量偏少，未能充分利用发酵液的糖类物质发酵；当酵母菌添加量为0.7%时，所得到的发酵液香气过于浓郁，且味道偏苦，滋味不柔和，可能是因为酵母菌添加量过多，糖分消耗迅速，酵母菌代谢速率快，产生大量的副产物，使感官得分降低[14]。因此，选用酵母菌添加量0.4%、0.5%、0.6%进行响应面优化试验。

图2 酵母菌添加量对酵母菌发酵阶段感官评价的影响

2.1.3 发酵温度对甘蔗芭蕉复合发酵液的影响由图3 可知，随着发酵温度的增加，复合发酵液的感官评分升高，随后又下降，在发酵温度为30℃时达到最高。温度为26 和34℃时，感官评分相对较低，可能是因为温度偏低，果酒酵母生长速度慢，发酵不够完全；发酵温度偏高时，果酒酵母代谢增强，衰老加快，对产品的风味和口感产生不利影响。因此，选用发酵温度为28、30、32℃进行响应面优化试验。

图3 发酵温度对酵母菌发酵阶段感官评价的影响

2.1.4 发酵时间对甘蔗芭蕉复合发酵液的影响由图4 可知，感官评分随着发酵时间的增加而上升，在26 h 时感官评分达到最高，所得的发酵液香气协调，风味最佳，而发酵时间为20 h 时，感官评分较低，复合发酵液香气不足，口感平淡。当发酵时间超过26 h 时，甘蔗芭蕉复合发酵液的口感略带苦涩，气味不协调。因此，选用发酵时间22、24、26 h 进行响应面优化试验。

图4 发酵时间对酵母菌发酵阶段感官评价的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 回归模型的建立及方差分析利用Design-Expert 8.0.6 软件对响应面试验进行设计，结果如表5 所示。对表5 中实验数据进行回归拟合，得到自变量（A初始糖度、B酵母菌添加量、C发酵温度、D发酵时间）与感官评分（Y）的二次多项回归方程为：

表5 响应面试验方案及结果

对表5 试验结果进行方差分析，结果见表6，该回归模型p＜0.05，方程模型显著，失拟项p=0.521 9＞0.05，不显著；该回归模型的决定系数R2=0.833 9，调整决定系数R2Adj=0.667 9，变异系数CV=1.95。试验结果表明，模型具有较好的适用性，试验的误差较低，因此所建立的回归方程的模型可以采用，利用该模型可以分析和预测甘蔗芭蕉复合发酵液酵母菌发酵阶段的发酵工艺条件。

由表6 可知，甘蔗芭蕉复合发酵液酵母菌发酵阶段的工艺参数中，影响感官评分的因素按主次顺序排列：初始糖度（A）＞酵母菌添加量（B）＞发酵温度（D）＞发酵时间（C），其中模型一次项A初始糖度影响极显著，B酵母菌添加量、D发酵温度显著，C发酵时间不显著；二次项B2、D2极显著，A2显著，C2不显著；交互项影响均不显著。

2.2.2 各因素交互作用的响应面采用Design Expert 8.0.6 软件对影响甘蔗芭蕉复合发酵液酵母菌发酵阶段的4 个因素进行交互分析，结果见图5。

用Design Expert 8.0.6 响应面分析软件优化试验结果，通过回归模型优化后的复合发酵液酵母菌发酵阶段最佳工艺条件为初始糖度16%、酵母菌添加量 0.48%、发酵时间 22 h、发酵温度30.18℃，在该条件下感官评分的预测值是90.89分。根据试验条件调整初始糖度为 16%、酵母菌添加量为0.5%、发酵时间为22 h、发酵温度30℃，按此条件进行3 次重复试验，所得甘蔗芭蕉复合发酵液酵母菌发酵的感官评分平均值为89.66 分，与预测值接近，表明响应面法所获得的模型参数是准确可靠的，能有效反映出各因素对甘蔗芭蕉复合发酵液的发酵效果。

2.3 乳酸菌发酵单因素试验结果分析

2.3.1 乳酸菌添加量对甘蔗芭蕉复合发酵液的影响由图6 可知，当乳酸菌的添加量低于3%时，复合发酵液的感官评分较低，口感偏差，原因可能是发酵菌种产酸不足，复合发酵液没有得到充分发酵。当乳酸菌添加量增加到3%时，感官评价分达到最高，此时复合发酵液香气协调，口感最佳，滋味酸甜适中，组织状态均匀。当乳酸菌添加量大于3.0%时，菌种发酵产酸能力过强，口感偏酸。因此，选择该因素进行正交试验的3 个水平为2.5%、3.0%、3.5%。

2.3.2 发酵时间对甘蔗芭蕉复合发酵液的影响由图7 可知，感官评分随着发酵时间的增加而上升，当发酵时间为12 h 时，感官评分达到最大值，复合发酵液的品质较好。当发酵时间超过 12 h时，感官评分显著下降，原因可能是发酵时间偏长，菌种大量繁殖，过多消耗了复合发酵液中的养分，从而使复合发酵液的味道变得酸涩、气味不协调[15]。因此，选择该因素进行正交试验的3个水平为8、10、12 h。

图7 发酵时间对乳酸菌发酵阶段感官评价的影响

2.3.3 发酵温度对甘蔗芭蕉复合发酵液的影响温度是影响乳酸菌生长发育及新陈代谢的主要因素。由图8 可知，在40～42℃时，感官评分随着发酵温度的升高而上升，超过43℃后感官评分明显下降，主要原因可能是温度偏低时，乳酸菌生长速度慢，新陈代谢速率低；温度较高时，酸化速度加快，对风味物质的生成不利，使得复合发酵液口感酸涩。因此选择该因素进行正交试验的3 个水平为41、42、43℃。

图8 发酵温度对乳酸菌发酵阶段感官评价的影响

2.3.4 乳酸菌发酵工艺优化正交试验根据乳酸菌发酵的单因素试验结果，以感官评分作为指标，选择三因素三水平L9（33）进行正交试验，考察A乳酸菌添加量（%）、B发酵时间（h）、C发酵温度（℃）3 个因素对甘蔗芭蕉复合发酵液乳酸菌发酵阶段的影响。乳酸菌发酵工艺优化正交实验结果如表7 所示，方差分析结果如表8所示。

表7 乳酸菌发酵工艺优化正交实验结果

表8 方差分析结果

由表7 可知，A2B3C3为最佳工艺组合，即乳酸菌添加量为3%、发酵时间为12 h、发酵温度为43℃。从试验结果可以看出，影响甘蔗芭蕉复合发酵液乳酸菌发酵阶段感官评分的3 个因素主次顺序依次为A＞C＞B。由表8 可知，乳酸菌添加量的影响极显著，发酵温度的影响显著，发酵时间的影响不显著。

2.3.5 验证试验结果分析由于正交试验表中没有出现最佳工艺组合A2B3C3，对此进行验证试验，在最佳工艺条件为乳酸菌添加量3%、发酵时间12 h、发酵温度43℃的情况下，进行3 次平行试验并取平均值，得到甘蔗芭蕉复合发酵液的感官评分为87.67 分，与正交试验表7 中所有因素组合相比，感官评分较高，可将A2B3C3作为甘蔗芭蕉复合发酵液乳酸菌发酵工艺的最佳组合。

2.4 甘蔗芭蕉复合发酵液体外抗氧化活性测定结果

根据甘蔗芭蕉复合发酵的最优制备工艺条件，对其进行体外抗氧化能力测定，同时以未发酵时的样品做为自身对照。结果如表9 所示，经酵母菌和乳酸菌共同发酵之后，甘蔗芭蕉复合发酵液较未发酵之前的抗氧化能力得到了较大提升，这与侯金丽[16]研究刺梨植物乳杆菌发酵饮料时的结果类似。

表9 甘蔗芭蕉复合发酵液抗氧化能力测定结果单位：%

3 结论

以甘蔗、芭蕉为原料，两原料以1:1（m:m）的比例混合均匀，采用酵母菌和乳酸菌协同发酵，制备甘蔗芭蕉复合发酵液。在单因素试验的基础上进行响应面分析，得出酵母菌发酵的最优工艺条件：初始糖度16%、酵母菌添加量0.5%、发酵温度30℃、发酵时间22 h；通过正交试验分析得出乳酸菌发酵的最优工艺条件：乳酸菌添加量3%，发酵时间12 h，发酵温度43℃。在此工艺条件下制备的甘蔗芭蕉复合发酵液色泽呈淡黄色，酸甜适宜，香气协调,口感醇厚。发酵后的甘蔗芭蕉复合发酵液pH、可溶性固形物含量、总酸分别为4.2、13.5%、3.95 g/100 mL。在最优条件下对甘蔗芭蕉复合发酵液进行体外抗氧化活性测定，发现该复合发酵液具有一定的抗氧化能力，DPPH自由基清除率达到60.97%，羟自由基清除率为45.09%，超氧自由基清除率为50.7%。

本研究采用酵母菌、乳酸菌协同发酵，不仅增加了产品的风味物质，还可调节人体肠道菌群，促进代谢和能量吸收，能较好地满足人们对水果复合发酵液饮品在营养、健康方面的追求，同时也可为广西甘蔗、芭蕉产业的深加工提供参考依据。