Nrf2-GPX4 信号通路与冠心病患者相关性研究

邢布点，李 辉，强甜甜，魏 婷，卢园园，康品方，张宁汝

（1.蚌埠医学院第一附属医院心内科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠医学院第一附属医院心脑血管疾病基础与临床重点实验室，安徽 蚌埠 233000；3.蚌埠医学院第一附属医院眼科，安徽 蚌埠 233000；4.蚌埠医学院附属蚌埠市第三人民医院，安徽 蚌埠233000）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是主要是由于冠状动脉狭窄或者供血不足，继而引发心肌供氧和血供应不足、心肌血管耗氧急剧增加，最终导致心肌坏死［1-3］。流行病学调查结果表明，CHD 严重危害人类生命健康，并呈现年轻化、发病率逐年上升的趋势［4］。

谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）是一种重要的抗氧化酶，能够将脂质ROS 还原为无毒的脂质醇，减少脂质过氧化，有效预防了细胞的氧化应激，从而抑制了铁死亡进程［5］。近期研究发现GPX4 介导的铁死亡与CHD 有着密切的联系［6］。Nrf2 抗氧化剂是细胞氧化应激和铁死亡重要的信号通路［7，8］。近年来相关研究发现，激活Nrf2 可通过促进GPX4 的表达进而抑制铁死亡［9，10］。而目前Nrf2-GPX4 信号通路介导的铁死亡在CHD中的发病机制尚不明确。本研究拟通过检测Nrf2及GPX4 水平，分析其与冠状动脉狭窄程度不同CHD 病人的关系，为CHD 诊断治疗提供新依据。

1 资料与方法

1.1 材料试剂

Nrf2 抗体（货号：12721S；产地：美国CST）、GAPDH 抗体（货号：5174；产地：美国CST）；ELISA 检测试剂盒：HumanNrf2（上海羽朵）、HumanGPX4（上海羽朵）

1.2 研究对象

收集2020 年6 月～2022 年6 月我院540 例疑诊CHD 患者，平均（64.52±9.66）岁，根据CHD 诊断指南［11］，以任意一支主要冠脉狭窄≥50%即可诊断为CHD。其中，360 例明确诊断为CHD，冠状动脉造影无异常180 例患者纳入CON 组。入选患者均签署知情同意书。所有入选患者均排除既往有心肌炎、心肌病、恶性肿瘤类疾病、风湿免疫系统疾病、内分泌及代谢性疾病及感染性疾病［12］。入选患者均签署知情同意书，研究方案获得本院伦理委员会批准（2019KY023）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 所有患者入院后空腹过夜后，抽取外周静脉血10 mL，置于肝素抗凝管中，3 000 r/min 离心10 min 后吸取上清，并于-80 ℃下冷冻保存备用。

1.3.2 ELISA 检测患者血清中Nrf2、GPX4 水平采用 HumanNrf2、GPX4（上海羽朵）检测受试者血清中Nrf2、GPX4 的表达水平，严格按说明书进行操作。

1.3.3 Western blot 检测Nrf2-GPX4 信号通路在CHD 组和CON 组中的Nrf2 蛋白的表达 提取PBMCS 中总蛋白，依据BCA 蛋白定量法，测定各组蛋白浓度，配置10%SDS-PAGE 电泳，PVDF 膜转膜，抗体稀释比：抗Nrf2 兔单克隆抗体1∶1 000、抗GAPDH 兔单克隆抗体1∶10 000；一抗二抗孵育；洗膜后ECL 发光液曝光，成像系统获取图像［13］。

1.3.4 统计学方法 组间比较采用t检验、卡方检验，应用Pearson 分析法分析指标间的相关性，以上数据采用SPSS26.0 软件分析。

2 结果

2.1 受试者一般资料和生化指标分析

与CON 组比较，CHD 组年龄、吸烟史、高血压病史、糖尿病史、TG、LDL 均是升高的；而HDL 却是降低的（P均＜0.05）；而两组间性别比、BMI、WBC、AST、ALT、TC、和Scr 无明显差异（P＞0.05），见表1。

表1 CON 组和CHD 组的一般资料和生化指标比较Tab 1 Comparison of general data and biochemical indexes between the CON group and the CHD group

2.2 CON 组和CHD 组受试者Nrf2、GPX4 以及Gensini 评分

与CON 组比较，CHD 组血清Nrf2、GPX4 活性水平均是降低的；而Gensini 评分却是明显增大的（P均＜0.05）。见表2。

表2 CON 组和CHD 组受试者Nrf2、GPX4 以及Gensini 评分比较(±s）Tab 2 Comparison of Nrf2，GPX4 and Gensini scores between the CON group and the CHD group(±s）

表2 CON 组和CHD 组受试者Nrf2、GPX4 以及Gensini 评分比较(±s）Tab 2 Comparison of Nrf2，GPX4 and Gensini scores between the CON group and the CHD group(±s）

指标CON 组CHD 组tP Nrf2（pg/mL）281.43±40.75 236.08±36.95-10.592 0.000 GPX4（ng/mL）76.17±11.62 35.36±4.65-13.272 0.000 Gensini 评分23.40±14.16 56.24±24.41 11.242 0.000

2.3 CON 组和CHD 组受试者（各90 例）PBMCS中Nrf2 蛋白表达水平

CHD 组Nrf2（0.25±0.05）蛋白表达水平较CON 组（0.87±0.16）是呈下调趋势的（P＜0.05），见图1、2。

图1 CON 组和CHD 组患者PBMCs 中蛋白条带Fig 1 Protein bands in PBMCs of patients in the CON and CHD groups

图2 两组PBMCs 中蛋白表达量相对大小Fig 2 Relative magnitude of protein expression in PBMCs of two groups of patients

2.4 Nrf2、GPX4 与Gensini 评分以及血液指标的相关性

经Pearson 相关性分析：血清Nrf2、GPX4 水平与Gensini 评分负相关（Nrf2：r=-0.347，P＜0.001；GPX4：r=-0.423，P=0.001）；Nrf2、GPX4 与TG负相关（Nrf2：r= - 0.284，P＜0.001；GPX4：r=-0.275，P=0.001）；Nrf2 和GPX4 水平与 LDL 呈负相关（Nrf2：r= - 0.418，P＜0.05；GPX4：r=-0.426，P＜0.05）；Nrf2 和GPX4 水平与HDL 呈正相关（Nrf2：r=0.318，P＜0.05；GPX4：r=0.428，P＜0.05）；Nrf2 与GPX4 呈正相关（r=0.456，P＜0.01）。见表3。

表3 血清Nrf2 及GPX4 活性水平与 Gensini 评分以及血液指标的相关性分析Tab 3 Correlation analysis of serum Nrf2 and GPX4 activity levels with Gensini scores and blood indexes

3 讨论

CHD 是临床上最常见、最主要的疾病，主要由冠脉粥样硬化介导的管腔狭窄或堵塞所导致，且随着冠脉病变的加重，从而更容易造成冠状动脉的狭窄或者供血不足，最终引起心肌功能障碍［14，15］。迄今为止，CHD 发病机制尚未明确。CHD 高致残率与致死率的特点，给患者的生命安全与生活质量造成影响。因而，深入地研究CHD 发生机理，有助于CHD 的诊疗及早期预防。

研究表明，血脂异常为CHD 发生的一种重要危险因素［16］。已有相关研究指出，高TG 血症、高LDL 血症、低HDL 血症与CHD 的发生、发展密切相关，且通过改善患者血脂水平，有利于缓解CHD症状，促进病情转归［17，18］。在本次研究中，CHD 组TG、LDL 明显高于CON 组，而HDL 水平却是降低的，考虑机制可能与血脂异常致动脉粥样硬化有关。

铁死亡是非凋亡的细胞死亡的一种形式，依赖于铁元素的脂质活性氧（ROS）的积累。脂质ROS在细胞内的不断堆积，引发细胞内的氧化应激反应，逐步诱发细胞的铁死亡［19］。近年来多项研究表明［20，21］，铁死亡与CHD 密切相关。

GPX4 是一种选择性中和脂质氢过氧化物的硒酶，被认为是铁死亡的重要内源性调节剂。有研究表明［22］，抑制GPX4 的活性，其催化的还原反应不能代谢过氧化脂质，脂质过氧化产生的Fe2+和ROS 的不断积累最终导致铁死亡。鉴于GPX4 在铁死亡进程中的起着重要作用，其成为铁死亡调控因子的研究热门。Meng 等［23］在糖尿病动脉粥样化小鼠模型中观察到，GPX4 活性降低引起脂质过氧化，继而引起铁死亡，促进了动脉粥样硬化的发展，而铁死亡抑制剂通过增加GPX4 活性，减少脂质活性氧的生成，进而减缓了动脉粥样硬化的发展，该现象表明GPX4 活性可能与可能与心肌缺血性疾病CHD 有潜在联系。FENG 等［24］研究发现，铁死亡抑制剂通过增加GPX4 活性，减少了脂质活性氧的生成，继而保护大鼠心脏减轻缺血性损伤。此外，Li 等［25］通过实验发现，恢复GPX4 活性水平，能够抑制铁死亡，继而可保护小鼠心肌免受缺血再灌注损伤。近期临床实验研究发现，ACS 患者GPX4 活性水平明显低于非ACS 病人［6］。这与本此研究结果相类似，本研究发现相较于CON 组，CHD 患者GPX4 活性水平是降低的，提示GPX4 可能参与了CHD 的发生、发展。

Nrf2 作为铁死亡主要调节因子，其不仅是氧化应激反应和铁死亡的参与者，同时也是氧化应激反应和铁死亡过程的调控者。Nrf2 调控着与铁死亡相关的酶和蛋白质如GPX4［9］。Yu 等［26］通过研究发现，抑制Nrf2 可通过下调GPX4 表达，增加了铁死亡，进而促进了小鼠动脉粥样硬化的形成，而铁死亡抑制剂可通过激活Nrf2，增加GPX4 表达，使铁死亡进程受抑制，继而抑制了小鼠动脉粥样硬化的形成，该现象表明Nrf2-GPX4 信号通路介导的铁死亡可能与CHD 有潜在的联系。据报道，柚皮素可以通过调节大鼠体内Nrf2-GPX4 信号通路，抑制铁死亡，减轻心肌缺血性损伤［27］。陈玉等［10］通过实验观察到，激活Nrf2-GPX4 信号通路，能够抑制铁死亡，减轻了大鼠心肌缺血性损伤。本研究结果显示，较CON 组相比，CHD 组患者血清Nrf2 活性水平是明显降低的，此外，本研究完善了PBMCS 中Nrf2 蛋白浓度的测定，WB 蛋白浓度变化趋势与ELISA 结果一致，缪莹［28］也报道了类似结果。Pearson 相关分析显示，CHD 患者血清Nrf2 与GPX4 呈正相关关系，而其作用机制可能通过氧化应激和铁死亡相互联系，从而可能参与了CHD 的发生、发展。

Gensini 评分是评估冠脉狭窄严重程度的有效方法，分值越高，提示冠脉狭窄越严重［29］。本次研究发现，Nrf2 和GPX4 与Gensini 评分均呈负相关，这一结果提示Nrf2-GPX4 信号通路介导的铁死亡与CHD 病变程度有关，对于评价CHD 患者严重性具有一定的积极意义。

综上所述，与CON 组比较，CHD 组血清Nrf2与GPX4 活性水平是降低的，Nrf2 与TG、LDL、以及GPX4 水平之间呈正相关，Nrf2 和GPX4 分别与HDL 呈负相关，且Nrf2 和GPX4 与Gensini 评分均呈负相关。因此，Nrf2-GPX4 信号通路介导的铁死亡对于判断冠脉病变程度及CHD 的发病机制具有一定的参考价值。本研究存在以下不足：纳入样本量少、数据误差不可避免，因此，本文结果还需大规模多中心研究进一步验证。

作者贡献度说明：

邢布点：数据分析、文章撰写工作；强甜甜、魏婷、卢园园：收集数据，负责相关实验操作；李辉、康品方、张宁汝：设计实验，指导写作。

作者声明不存在利益冲突关系。