水蛭真伪鉴定和质量评价方法研究进展

吉舒琪,张慧婷,王梦轩,宫玉洁,王艺颖,刘玉姣,董红敬,张波

(1.临沂大学药学院,山东 临沂 276000;2.齐鲁工业大学<山东省科学院>,山东省分析测试中心,山东省大型精密分析仪器应用技术重点实验室,山东 济南 250014)

水蛭为水蛭科动物蚂蟥(WhitmaniapigraWhitman)、水蛭(HirudonipponicaWhitman)或柳叶蚂蟥(WhitmaniaacranulataWhitman)的干燥全体,具有破血通经,逐瘀消癥功能,主治血瘀经闭,癥瘕痞块、中风偏瘫以及跌打损伤等疾病[1]。近年来研究发现水蛭相关制剂在防治心脑血管疾病和抗癌方面具有特效,多用于急性结膜角膜瘢翳等临床症状,且以水蛭为原料的中成药如通心络胶囊、脑血康滴丸、脑心通胶囊等更是被纳入2019年的《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》[2]。可见,水蛭功效显著,应用广泛。

水蛭属于动物类中药,其野生资源匮乏且养殖技术要求高,加上水蛭药材市场需求量增大,导致价格偏高且供不应求。因此,市场上出现多种水蛭混伪品,致使水蛭质量参差不齐,严重影响临床用药的安全性与有效性。故加强水蛭的真伪鉴别与质量评价方法的研究与利用具有十分重要的意义。

鉴于上述情况,本研究以中国知网、维普网、万方数据、PubMed、Science Direct、Web of Science等数据库中查询的2000年1月—2022年8月发表的相关文献为参考资料,对水蛭的真伪鉴别和质量评价方法进行了综述,旨在为临床使用更安全有效的水蛭药材提供更多保障,亦为水蛭药材的质量控制方法研究提供参考。

1 真伪鉴别

正品医用水蛭来源为《中国药典》收载的蚂蝗(宽体金线蛭)、水蛭(日本医蛭)和柳叶蚂蝗(尖细金线蛭)[1]。但由于主观掺入或无意混用,市场上出现了多种水蛭药材的混伪品,如伪品菲牛蛭(Hirudinariamanillensis)、天目山蛭(Haemadipsalimuna)以及Erpobdellabscura等。现有研究多通过性状鉴别、理化鉴别和分子鉴别等技术手段进行真伪鉴别。

1.1 性状鉴别 不同于植物类药材的主要性状特征,水蛭及其伪品的性状鉴别点主要在于生殖孔、尾部吸盘、背部纹理、前端吸盘开口部位、颚齿等多个方面的差异[3](详见表1)。水蛭的性状鉴别主要靠其专属性的性状特征,大多是利用感官去鉴别,主观因素影响大,且水蛭的性状会受到外界环境变化的影响,不同地区的水蛭在大小,性状上也存在着一些差别,鉴别准确度较低[4]。

表1 水蛭及其伪品性状鉴别特征汇总

1.2 理化鉴别 薄层色谱是较为常用的理化鉴别方法,《中国药典》2020年版采用的水蛭薄层色谱鉴别方法条件为：以环己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂,硅胶G薄层板为固相载体,通过喷加10%硫酸乙醇溶液并置105 ℃烤板后进行斑点显色,与标准药材对照鉴别[1]。

1.3 分子鉴别 分子鉴别方法是现代中药鉴别中的研究热点,具有结果客观、准确、取样少、不受检测样品性状影响等优点,在动物类药材的真伪鉴别中应用较为广泛[7]。COI基因片段是水蛭DNA条形码的有效候选基因之一,王文秀等[8]通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的COI序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性引物后进行PCR扩展,依据是否有明显扩增条带或核酸染料是否有荧光进行真伪鉴别。刘杰等[9]通过PCR和微芯片电泳检测的方法可以同步鉴别3个品种水蛭的人为预混样品,且不存在引物之间相互结合或非特异性扩增的现象,鉴别结果准确。

除水蛭生药和粉末采用上述方法外,含水蛭的中成药的鉴别也多采用此法,朱晓枭等[10]基于COI基因序列,分别设计了针对宽体金线蛭和日本医蛭的特异性引物,用于特异性鉴别脑心通胶囊中水蛭的有效成分及质量监测。另外,刘晓帆等[11]基于COI序列,通过邻接法所构建的系统聚类树图发现同属序列聚在一起,水蛭的正品来源宽体金线蛭、日本医蛭形成一个独立的支,支持率近100%,其他伪品聚集为独立的一支,说明水蛭的正品来源与其伪品能够明显区分开。

1.4 蛋白质电泳法鉴别 蛋白质电泳鉴别技术是依据中药中所含蛋白质分子的大小、形状或所带电荷差异,采用电泳分离来鉴别中药的方法[12]。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是胶体电泳的一种,其将蛋白质溶液与SDS混合,SDS为界面活性剂,会破坏蛋白质的二级结构使其变性并包覆变性蛋白质,使其带有一致的负电荷和一致的形状,故蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关[13]。

水蛭主要成分为大分子化合物如蛋白质,其次还含有氨基酸、喋啶类、类以及脂肪酸类成分等[14]。不同品种或不同生长环境的水蛭其蛋白质组成及含量上有所差异,基于此,汪波等[15]采用SDS-PAGE对我国7种常见水蛭的组织细胞可溶性蛋白成分进行电泳图谱特性分析,结果表明SDS-PAGE能初步反映不同种类、不同食性水蛭组织细胞可溶性蛋白质的表达差异,可用于不同品种水蛭的鉴别。

1.5 毛细管电泳法 刘兴国等[16]采用高效毛细管电泳法对宽体金线蛭和混淆品菲牛蛭进行蛋白、多肽的分析,发现宽体金线蛭与菲牛蛭的高效毛细管电泳图谱之间有明显差异,且重复性良好。

2 质量评价

目前,对于水蛭的质量评价除常规的水分、总灰分、酸不溶性灰分检测以外,还包括其特异性的质量评价手段,如抗凝血酶活性测定以及针对水蛭中蛋白质类、核苷类、多胺类、挥发性成分等不同化学成分的定性定量评价。

2.1 生物检定技术 水蛭中含有多种抗凝剂,据研究报道水蛭素已经广泛用于脑血栓、冠心病、脑水肿[17]、糖尿病[18]等的治疗,已发现且可直接作用于凝血系统的成分主要有水蛭素、吻蛭素、类肝素、组胺等[14]。因此,抗凝血活性是水蛭的主要活性,也是《中国药典》[1]中评价水蛭质量的主要方法,其检测方法为生物活性测定法,该方法用于中药质量控制,可以反映中药的整体或者主要的药理作用,与单纯控制指标性成分有较大的进步。

除药典方法外,多位学者还创新了一些新的水蛭抗凝血酶评价方法,如苏斌等[19]建立了一种基于用血液凝固分析仪测定纤维蛋白原-凝血酶时间的水蛭生物活性测定方法(Fibg-TT法),其就基源为蚂蟥和日本医蛭分别建立了反应体系,用生物检定统计法测定供试品的效价,结果表明蚂蟥和日本医蛭标准品的效价分别为5 650 U·g-1和4 130 U·g-1,当两者浸提液的一定浓度范围时,对数凝固时间与浓度线性较好,准确度和中间精密度均良好,证明Fibg-TT法能区分和量化不同批次水蛭的效价。金家金等[20]将不同浓度的水蛭浸提液加入富血小板血浆和乏血小板血浆中,结果显示水蛭能增加血小板聚集率,对凝血酶原时间未见显著性的影响,能显著延长活化部分凝血酶时间和纤维蛋白原-凝血酶时间,在一定的浓度范围内,水蛭浸提液浓度与纤维蛋白原-凝血酶时间的对数凝固时间呈现较好的线性关系,证明了Fibg-TT和活化部分凝血酶时间(APTT)反应体系可以用于水蛭体外生物活性测定。肖凌等[21]将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定,探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法,结果表明4种水蛭活性部分凝血酶时间法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似,突跃范围呈平行关系,上述特点符合生物检定的要求,以肝素钠作为标准品,采用生物检定技术活性部分APTT测定水蛭等的抗凝活性是可行的,证明了活化部分APTT可以全面反映水蛭的抗凝血作用,测定结果对临床使用更具指导意义。

2.2 SDS-PAGE法 水蛭不仅存在品种的差异,不同的炮制方法对其药物质量也有一定的影响。国家和地方炮制规范对水蛭烫制工艺的温度、时间、滑石粉用量、翻炒速度等关键参数均无统一规定,大多凭主观经验评价,从而影响了炮制品质量。现代研究发现炮制方法不同,水蛭炮制前后的水溶性蛋白存在一定差异。

马莉等[22]采用双向电泳分析水蛭酒炙前后差异蛋白表达,结果发现直接裂解液法所得条带数量最多,分布连贯清晰;水蛭酒炙前后蛋白含有量有显著性差异,所以双向电泳所得差异蛋白可作为蛋白标志物,以规范水蛭炮制工艺,并确保其稳定性。

2.3 HPLC法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法,注入的供试品由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号,具有灵敏度高、重复性好、易于标准化等优点。多位学者尝试建立了用于水蛭化学成分分析的HPLC方法[23-25](见表2),以期更好地对水蛭进行质量评价。

表2 HPLC 检测水蛭中的化学成分

此外,HPLC还可以与质谱联检测器用(HPLC-MS),HPLC-MS可综合HPLC与MS的优势于一体,实现对目标样品的多成分准确鉴别。如朱晓枭等[26]利用HPLC-MS技术研究脑心通胶囊中的蛋白质,其基于超高分辨质谱技术及蛋白质组学的方法用于脑心通胶囊中3种动物药的蛋白质分析,此研究弥补了脑心通胶囊中蛋白类成分研究的空白,实现了对于脑心通胶囊中多种成分的准确鉴别。

2.4 IR法 IR技术具有快速、无损、无污染以及可视化等优点,可有效反应药材组织上的官能团信息。李彦希等[27]基于红外光谱法结合化学计量学进一步对光谱数据进行分析,结果水蛭与美洲大蠊、全蝎的红外指纹图谱有差异,3种虫类药材在1 800～1 700 cm-1处峰形差异明显较大,二阶导数产地特征峰差异明显,说明IR技术可用于鉴别水蛭及其混淆品,可作为水蛭质量评价方法之一。

2.5 GC-MS法 挥发性成分与抗凝血酶活性是水蛭的质量鉴别指标之一,挥发性成分的差异与种质及其生长环境密切相关,因此通过比较水蛭挥发性成分与抗凝血活性成分组成及含量差异可以从一定程度上反应药材的质量差异。黄荣清等[17]应用GC-MS技术分析鉴别了水蛭提取物中有很强的抗凝血活性的15个化合物,主要为不饱和脂肪酸甲酯以及甾体等。而刘君等[28]采用GC-MS法分析了中药蚂蟥脂肪酸的组成,鉴别了19个组分,其中不饱和脂肪酸占71.84%,饱和脂肪酸占20.71%,为水蛭鉴别提供了数据支撑。隋利强等[29]通过SPME-GC-MS分析探讨了炮制对水蛭挥发性成分的影响,结果从水蛭的挥发性成分中鉴别出40种化合物。水蛭炮制前后挥发性成分含量差异明显,炮制过程中棕榈酸的含量降低。

2.6 指纹图谱技术 指纹图谱技术可从整体上反应药材质量,避免了以单个或少数几个指标性成分为依据的中药质量评价略显片面的问题,在中药质量评价领域应用十分广泛。目前所建立的水蛭的指纹图谱主要分为HPLC指纹图谱和SDS-PAGE指纹图谱两类。产地、品种的差异均会导致水蛭基因表达的差异,进而导致化学成分的差异,最终形成不同的药材质量。指纹图谱技术即是以多批次药材的成分分析结果来评价药材质量的一致性或稳定性,而HPLC指纹图谱和SDS-PAGE指纹图谱的区别主要在于,HPLC指纹图谱是以小分子化合物为研究对象,SDS-PAGE指纹图谱则是以蛋白质大分子为研究对象。现有水蛭指纹图谱信息见表3[30-34]。

表3 水蛭指纹图谱信息

2.7 灰度关联质量评价模式 李峰等[35]在对不同品种、不同规格的水蛭中多个成分(核苷类、多胺类、总多糖、总磷脂、蛋白质)和抗凝血酶活性测定的基础上,通过定义的相对关联度为测度,建立了灰关联度模型,用以评价水蛭质量,该评价模式全面客观。

3 讨论与总结

3.1 水蛭真伪鉴别方法研究现状 目前,水蛭的真伪鉴别方法主要性状鉴别、理化鉴别、分子鉴别、SDS-PAGE鉴别、毛细管电泳法鉴别等多种方法。性状鉴别中,不同品种水蛭在大小及各部位组织特征上有一定差异,可实现结构未被破坏生药的鉴别,但对于含水蛭的中成药中水蛭原料真伪无法鉴别;理化鉴别则以对照药材为依据进行鉴别,方法简便高效;分子鉴别主要以COI基因片段为研究对象,通过位点特异性PCR或分子进化树等实现水蛭的鉴别,同时可用于水蛭粉末及其中成药的鉴别,方法准确性最高;由于水蛭为动物药材,蛋白质信息丰富,因此SDS-PAGE鉴别法和毛细管电泳法鉴别也较为常用,且适用于不同品种,不同产地水蛭的鉴定。

3.2 水蛭质量评价方法研究现状 水蛭的质量评价方法主要以生物检定技术、SDS-PAGE、HPLC、GC-MS、IR、指纹图谱技术等为主。水蛭抗凝血活性显著,也是其临床应用的主要活性之一,因此采用生物检定技术对其抗凝血活性进行检测是评价水蛭的主要方式之一。SDS-PAGE主要以水蛭中的蛋白质为评价对象,但该方法受到提取条件的影响较大,且多以定性评价为主,无法定量;HPLC多以水蛭中的胺类、核苷类和喋啶类成分为评价对象,而GC-MS则以水蛭中的脂肪酸、甾体为主要评价对象,对于目前尚未明确水蛭药效物质基础的情况下,指标性成分的选择对质量评价的实际意义具有局限性;IR和指纹图谱技术则是从整体上评价水蛭质量的常用方法,目前指纹图谱仍以HPLC和SDS-PAGE检测技术为主。此外,灰关联度模式在动物类药材质量评价中也有较广泛应用,且具有指标丰富,评价客观等优点。可见,目前对于水蛭的质量评价方法研究虽然较为广泛,但方法的适用性和实际价值还有待深入研究,目前以抗凝血酶活性评价的生物检定法和整体评价的指纹图谱技术具有较高实用价值。

4 展望

水蛭为临床常用动物药材之一,目前已经明确水蛭素是其主要抗凝血成分,但水蛭临床应用炮制品常需要滑石粉烫制,高温处理易导致水蛭素失活,可见水蛭活性成分并非仅包含以水蛭素为代表的蛋白质类成分,还包含其他活性成分。再者,水蛭除活血化瘀外的多种药效如抗肿瘤[36-37]、抗纤维化[38]、抗糖尿病肾病[39-40]等亦可佐证。因此,对于水蛭的质量评价方法应充分考虑水蛭的多活性、多物质基础的特点,开发更加综合全面的质量评价方法。或者深入研究药效物质基础,从而建立针对物质基础的定性定量评价方法。而对于真伪鉴别方法而言,通过性状鉴别结合分子鉴别的手段基本可满足水蛭中药材和中成药的鉴定,但仍应向简便化、现场化应用的实际应用方向继续开发。