洋甘菊活性组分对LPS诱导人支气管上皮细胞的保护作用及机制研究

娜迪热·艾尔肯,彭军,3,范芳芳,李茜

(1.新疆医科大学第四临床医学院,新疆 乌鲁木齐 830000;2.新疆中药炮制研究重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830000;3.新疆理化技术研究所干旱区植物资源与化学重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830000)

支气管哮喘(哮喘)是一种常见的慢性炎症性呼吸道疾病,影响着超过3.3亿儿童和成人,预计到2025年受影响的人口将增加到4亿[1]。随哮喘患病率的升高,已成为我国的一项重大公共卫生挑战。驱动蛋白家族 3A 基因(Kif3a)是哮喘的易感性位点之一,在Kif3a敲除的哮喘小鼠模型中小鼠气道反应明显增高[2]。Hedgehog(HH)基因家族共包括3个成员Sonic hedgehog(SHH)、Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH),SHH信号通路的上调诱导过敏性哮喘[3-4]。Kif3a的敲除或者突变会阻断Hedgehog信号的传导[5]。因此,Kif3a可通过调控SHH信号通路改善哮喘气道炎症,有效缓解哮喘症状。目前临床治疗中,常用药物是抗炎糖皮质激素及支气管扩张剂等,但长期使用引起不良反应[6]。近年来,中药在减轻哮喘症状、控制哮喘发作、防止哮喘复发等方面具有治疗优势[7]。

洋甘菊又名母菊,拉丁名MatricarlachamomillaL.,《中华本草》中记载其具有散气消炎、软坚消肿、祛风止痛等功效。现代研究表明,洋甘菊具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗抑郁、抗癌、保肝、抗糖尿病等多种药理活性[8]。洋甘菊作为新疆地区习用药材,是新疆传统名方祖卡木颗粒的主要药材之一,治疗呼吸系统疾病历史悠久[9]。洋甘菊醇提取物通过调节Th1/Th2的平衡对Balb/c小鼠巨噬细胞和淋巴细胞产生影响,发挥抗炎作用[10]。在一项关于短期服用传统草药的临床试验中,发现洋甘菊可以显著改善儿童普通感冒的哮喘症状[11]。然而,洋甘菊在改善和缓解哮喘症状的作用机制仍不清楚。前期,我们已通过工艺优化获得洋甘菊的活性组分,总黄酮含量为30.55 mg·g-1,其主要活性成分为黄酮(芹菜素、木犀草素)或类黄酮醇衍生物(槲皮素)[12]。本实验将进一步研究洋甘菊活性组分改善脂多糖(LPS)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)的损伤,并探讨其保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 16HBE购自上海雅吉生物。

1.2 仪器与试剂 Smart Cell HF-90CO2细胞培养箱(上海力康仪器有限公司);TDL-60B台式低速离心机(上海安亭仪器厂);LSRFortessa流式细胞仪(BD);MyCycler Thermal Cycler PCR仪(Bio-Rad);7500 Fast Real Time PCR instrument(ABI);Mini-PROTEAN Tetra system蛋白转膜仪(Bio-Rad);xMarkTM酶标仪(Bio-Rad)。

角质细胞培养基 KM(Sciencell,批号：2101);青霉素-链霉素双抗(10 000 U)(Gibco,批号：15070-063);PBS磷酸盐缓冲液粉剂(北京中杉金桥生物,批号：ZLI-9062);CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒(全式金生物,批号：FC101-03);脂多糖(Sigma,批号：L2630);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成,批号：A020-2-2);地塞米松(Sigma,批号：D4902);Annexin V-PE/7AAD Kit(BD,批号：559763)。一抗：beta-Actin (批号：100166-MM10)购自义翘神州;SHH (C9C5)抗体(批号：#2207)和KIF3A (D7G3)抗体(批号：#8507)购自美国CST公司;Anti-Gli1抗体(批号：ab273018)购自Abcam公司;Ptch1 抗体(批号：PA5-87508)购自赛默飞。二抗：山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(批号：ab205718)和山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(批号：ab205719)购自Abcam公司。

1.3 实验方法

1.3.1 洋甘菊活性组分的制备 洋甘菊活性组分的制备工艺参数[12]：70%乙醇,料液比1∶10(W/V),回流提取1次,时间1 h。

1.3.2 16HBE的培养与炎症模型细胞建立 16HBE采用角质细胞培养基 KM(含1%双抗)于37 ℃、饱和湿度、5% CO2细胞培养箱中培养,细胞密度超80%,即可进行传代培养,进入对数生长期后用于实验。LPS(2.5 μg·mL-1)干预16HBE 16 h,建立炎症细胞模型。

1.3.3 洋甘菊活性组分药物干预浓度及时间摸索 收集16HBE,用完全培养基制备成5×104mL-1单细胞悬液,接种至96孔板中(100 μL/孔),37 ℃、5% CO2培养24 h贴壁后,加入不同浓度洋甘菊活性组分(0、1、10、100、200、400 μg·mL-1),分别干预24 h和48 h。

1.3.4 实验分组 将处于对数生长期的细胞分成以下4组：空白对照组、LPS模型组、阳性药物组(1 μmol·L-1地塞米松干预2 h)、洋甘菊活性组分组(200 μg·mL-1,48 h)。

1.3.5 CCK-8检测细胞增殖 将16HBE接种至96孔板中(5×103/孔),37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h贴壁后,分别按照“1.3.2”和“1.3.3”项下方法进行干预。加入100 μL配制好的10% CCK-8溶液,继续孵育1 h后用酶标仪测定450 nm处的OD值。

1.3.6 LDH水平检测 将16HBE接种至96孔板中(5×103/孔),37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h贴壁后,按照“1.3.2”项下方法干预后,收集上清,在室温下以1 000 r·min-1离心10 min,用酶标仪测定上清中LDH活性。

1.3.7 流式检测细胞凋亡 收集16HBE,用完全培养基制备成5×104mL-1单细胞悬液,接种至6孔板中;按实验分组处理后,将每组细胞瓶内的培养液与细胞一并吸至离心管内(内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞),1 000 r·min-1离心5 min,弃上清。用预冷的PBS洗涤2遍,弃干净上清。加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞,过200目筛网,制成单细胞悬液。每管加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD,轻轻混匀,4 ℃避光放置5 min。在30 min内进行流式细胞仪检测。

1.3.8 实时荧光定量检测基因表达 用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA,使用cDNA反转试剂盒将所有RNA逆转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法定量分析kif3a、SHH、Ptch1、Glil mRNA的表达情况。引物采用 Primer Premier 5.0 设计,由生工生物技术公司合成。引物序列见表1。热循环程序包括在94 ℃下保持2 min, 30个循环,如下：94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s。内参为GAPDH。采用2-ΔΔCt法计算相对mRNA表达量。

表1 荧光定量mRNA检测引物信息表

1.3.9 Western blot分析 用RIPA裂解后,从细胞中提取总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度后,对蛋白进行SDS-PAGE电泳和PVDF膜转移,随后5%的脱脂牛奶封闭1 h。PVDF膜在4 ℃下孵育一抗过夜,抗体稀释倍数为1∶1 000。室温下孵育二抗1 h。使用ECL检测试剂盒检测免疫标记条带(蛋白质条带)的化学发光信号。

2 结果

2.1 LPS诱导炎症模型 结果显示,通过2.5 μmol·L-1LPS干预16HBE 16 h建立炎症细胞模型。LPS干预后,细胞增殖能力降低(n=5,与空白对照组比较,P<0.05),LDH释放增加(n=5,与空白对照组比较,P<0.05),见图1。

图1 LPS干预对细胞增殖及释放LDH的影响

2.2 洋甘菊活性组分对细胞增殖的影响 结果显示,通过加入0、1、10、100、200、400 μg·mL-1的洋甘菊活性组分,分别干预24 h和48 h,发现洋甘菊活性组分干预浓度200 μg·mL-1,时间48 h后细胞活性被有效逆转,见图2(n=5)。LPS干预后显著抑制了细胞的增殖,而干预浓度200 μg·mL-1的洋甘菊活性组分可以有效逆转LPS对细胞的损伤,促进16HBE增殖,见图3(n=5,与空白对照组比较,P<0.05;与模型组比较,P<0.05)。因此,采用浓度200 μg·mL-1的洋甘菊活性组分进行后续研究。

图2 洋甘菊活性组分浓度摸索

图3 洋甘菊活性组分对LPS干预后细胞增殖及凋亡的影响

2.3 洋甘菊活性组分对细胞凋亡的影响 结果显示,2.5 μmol·L-1LPS干预后显著诱导16HBE的凋亡。200 μg·mL-1洋甘菊活性组分干预48 h后,逆转了LPS诱导的细胞凋亡见图3和图4(n=5,与空白对照组比较,P<0.01;与模型组比较,P<0.01)。

A.空白对照组;B.LPS模型组;C.LPS模型+地塞米松组;D.LPS模型+洋甘菊活性组分组图4 洋甘菊活性组分对LPS干预后细胞凋亡的影响

2.4 洋甘菊活性组分对Kif3a和SHH信号通路中关键指标基因表达的影响 Kif3a是调控微管功能和运输的异三聚体驱动蛋白2的亚基,其基因位点被多次证明与哮喘相关,通过前期蛋白组学实验筛选出Kif3a可能调控Sonic Hedgehog(SHH)信号通路。LPS干预后,16HBE中Kif3a基因表达水平降低,SHH信号通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil基因表达升高。洋甘菊活性组分有效逆转以上指标的变化,促进Kif3a基因表达,抑制SHH信号通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil基因表达降低,见图5(n=3,与空白对照组比较,P<0.05;与LPS模型组比较,P<0.05)。

A.洋甘菊活性组分对LPS干预后Kif3a基因表达影响;B.洋甘菊活性组分对LPS干预后SHH基因表达影响;C.洋甘菊活性组分对LPS干预后Ptch1基因表达影响;D.洋甘菊活性组分对LPS干预后Glil基因表达影响图5 洋甘菊活性组分对LPS干预后Kif3a基因及SHH通路的影响

2.5 洋甘菊活性组分对Kif3a和SHH信号通路中关键蛋白表达的影响 结果显示,LPS干预后,16HBE中Kif3a蛋白表达水平降低,SHH信号通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil蛋白表达升高。洋甘菊活性组分有效逆转以上指标的变化,上调Kif3a蛋白表达,抑制SHH信号通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil蛋白表达降低,见图6和图7(n=3,与空白对照组比较,P<0.05;与LPS模型组比较,P<0.05)。

A.洋甘菊活性组分对LPS干预后Kif3a蛋白表达影响;B.洋甘菊活性组分对LPS干预后SHH蛋白表达影响;C.洋甘菊活性组分对LPS干预后Ptch1蛋白表达影响;D.洋甘菊活性组分对LPS干预后Glil蛋白表达影响图6 洋甘菊活性组分对LPS干预后Kif3a蛋白及SHH通路的影响

图7 洋甘菊活性组分对LPS干预后Kif3a蛋白及SHH通路的影响

3 讨论

哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病,近年来其发病率呈不断上升趋势,给个人身心健康和家庭生活质量带来了严重影响。其发病机制十分复杂,主要的发生由于Th2的过表达,致使Th1/Th2之间失衡,并且Th2细胞分泌的物质与气道炎症、分泌物增多及纤维化密切相关[13]。哮喘的病理变化的基础是气道炎症,因此本研究中采用LPS诱导16HBE,建立哮喘炎症细胞模型。LPS干预后,16HBE受损、活力显著降低并诱导细胞的凋亡。洋甘菊富含黄酮类活性成分,具有抗氧化、消炎等功效。本研究中发现,洋甘菊活性组分在浓度200 μg·mL-1处理48 h时,可以显著逆转LPS对细胞的损伤并促进增殖,减弱LPS诱导的细胞凋亡,对哮喘炎症16HBE起到保护作用。因此,进一步探讨洋甘菊活性组分在治疗和改善哮喘炎症16HBE的作用机制。

近年来,Kif3a基因已被发现在哮喘患者中异常表达,并且哮喘气道炎症中发挥重要作用的IL-4以及IL-13位于该区域,因此该靶点是参与哮喘气道炎症调控的可能机制,是治疗哮喘的新的靶点和方向[2,14]。它可编码驱动蛋白2(kinesin-2)的运动亚单位,在调节细胞增殖、凋亡、分化、细胞内运输等具有重要作用[15]。Kif3a是纤毛运动蛋白马达的一部分,在肺中活动纤毛可协助黏液纤毛发挥清除作用,纤毛细胞通过多种信号通路(如SHH)介导信号传导,影响细胞形态发生、稳态和器官的修复[15-16]。Hedgehog(HH)信号通路中HH蛋白与Ptch结合可解除对Smo的抑制作用,导致下游Gli修饰为转录激活因子,进入细胞核内激活Gli1和Ptch1等靶基因转录。目前,已有一些研究表明SHH信号通路在支气管哮喘的发病过程中起着重要的作用[15,17-18]。本研究中,LPS干预后,16HBE内Kif3a在转录水平和蛋白表达水平显著降低,SHH、Ptch1、Gli1在转录水平和蛋白表达水平显著升高,表明哮喘炎症细胞中SHH信号通路处于异常激活状态。之前研究发现,Kif3a敲除的小鼠对空气过敏原烟曲霉和室内尘螨提取物高度敏感,导致气道高反应性和Th2介导的嗜酸性粒细胞炎症增加[15]。本实验中,洋甘菊活性组分处理后可显著逆转蛋白表达,增加Kif3a转录和蛋白表达水平并降低SHH、Ptch1、Gli1转录水平和蛋白表达。因此,洋甘菊活性组分可以通过上调Kif3a,并进一步下调SHH信号通路,保护LPS诱导损伤的16HBE。

本研究表明,洋甘菊活性组分可逆转LPS对16HBE的损伤和凋亡,通过Kif3a调控SHH信号通路,改善哮喘气道炎症,在哮喘治疗中发挥作用。