黄芪对急性辐射损伤小鼠预防作用的研究

韦唯唯,郑祖安,王佳伟,杜光

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科,湖北 武汉 430030;3.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,湖北 武汉 430030;4.国家重大公共卫生事件医学中心,湖北 武汉 430030)

随着核技术在医学、国防、农业生产等领域的广泛应用,核辐射日益成为威胁人类健康的重要因素,对造血系统和免疫系统均造成损伤,严重者诱发出血、贫血、感染甚至死亡等并发症[1-3]。研究发现,黄芪多糖(APS)可增加免疫器官重量,提高免疫器官指数[4]。也可在体外刺激RAW 264.7巨噬细胞分泌免疫调节因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α[5]。本文主要研究黄芪对辐射损伤小鼠的免疫器官损伤及外周血细胞减少的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 30只SPF级雄性Balb/c小鼠,6周龄,体质量(20±2)g,由成都药康生物科技有限公司提供,动物生产许可证号：SCXK(川)2020-034。动物使用许可证编号：SYXK(鄂)2019-0106。饲养于华中科技大学同济医学院附属同济医院科研楼SPF级动物房。

1.1.2 实验药物与试剂 黄芪(批号：211001,武汉同济医院中心药房);氯化钠注射液(批号：00078,武汉择而优科技发展有限公司);乙醇(批号：10009218,国药);二甲苯(批号：10023418,国药);苏木素染液(批号：BA-4041,贝索生物);环保封片剂 (武汉同声科技);石蜡 (广东大川特种有限公司);Harris苏木素染色液(批号：BA4041,贝索生物);醇溶性伊红(批号：AIGMA-230251);盐酸(批号：10011028,国药)。

1.1.3 实验仪器 X直线加速器(中法院区同济医院肿瘤放疗科提供);天平(型号：JA2003,YUEPING);生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司);倒置显微镜(深圳市奥斯微光学仪器有限公司);数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);超优刀片(批号：超优刀片325,Thermo);石蜡切片机(型号：Shandon Finesse 325,Thermo);显微镜(型号：CX31,奥林巴斯),包埋机(型号：BMJ-A,常州市中威电子仪器有限公司);病理组织漂烘仪(型号：PHY-III,常州市中威电子仪器有限公司);显微镜载玻片(批号：TS-NRS029,南通天盛新能源科技有限公司);高品质显微镜盖玻片(批号：10212432C,世泰)。

1.1.4 药物制作方法 黄芪购自湖北省武汉市同济医院中心药房,先用蒸馏水浸泡30 min,使其质地松软,以便活性成分的煎出。因黄芪属补益类中药材,宜用文火慢煎。黄芪水煎液浓缩至原药材的3 g·mL-1。运用等效剂量换算法计算小鼠的灌胃量是人临床用量的5倍[6]。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立、分组及给药 采用照射剂量为5 Gy,剂量率为6 Gy·min-1对小鼠进行一次性全身照射,建立急性辐射损伤模型[7]。

1.2.2 分组及给药 适应性喂养1周后,将30只SPF级雄性Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、黄芪组,每组10只。正常组和模型组小鼠每天灌胃生理盐水,黄芪组小鼠每天灌胃黄芪水煎液,持续14 d。第15天,除正常组外,其余各组小鼠均给予5Gy X射线一次性全身照射,

1.3 检测指标

1.3.1 外周血细胞检测 先用眼科剪把小鼠的胡须剪干净,防止血液从胡须处留下引起溶血,影响检测结果。左手拇指按压小鼠眼部皮肤,使眼球突出,然后用弯头镊子迅速摘眼球,使血液从眼眶内流入EDTA-K2抗凝管中,全自动血液细胞分析仪检测血细胞。

1.3.2 取胸腺和脾脏并计算脾脏和胸腺指数 取材前称取小鼠体质量。摘眼球取全血后,颈椎脱臼处死小鼠,左手持弯头镊子夹起小鼠腹中线左侧皮肤,右手持眼科剪从小鼠双后肢连线的中点剪至颈部。取出胸腺和脾脏,用滤纸吸干残血并称重,分别计算小鼠胸腺和脾脏指数。

1.3.3 脾脏HE病理切片的制备 ①用4%多聚甲醛固定小鼠脾脏24～48 h;②酒精由低浓度到高浓度逐级脱水,然后用透明剂二甲苯透明,用石蜡置换组织块中二甲苯透明剂,用熔点为52～60 ℃的石蜡进行包埋;③组织切片的厚度为5 μm;④经苏木精-伊红(HE)染色等步骤后,观察脾脏组织结构变化。

2 结果

2.1 照射后各组小鼠外周血细胞变化情况 照射后8 d,与正常组比较,模型组小鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,黄芪组小鼠外周血WBC、RBC、HGB显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,黄芪组小鼠外周血PLT未明显升高,差异无统计学意义(P>0.05),结果见表1。

表1 照后8 d各组小鼠外周血细胞计数的比较

2.2 照射后各组小鼠脾脏、胸腺变化情况 照射后8 d,与正常组比较,模型组、黄芪组小鼠脾脏指数、胸腺指数显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,黄芪组小鼠脾脏指数、胸腺指数未明显升高,差异具无统计学意义(P>0.05),结果见表2。

表2 照后8 d各组小鼠脾脏、胸腺指数比较

2.3 照射后各组小鼠脾脏形态学变化 照射后8 d,正常组小鼠脾脏红、白髓分界清楚,淋巴细胞丰富。模型组小鼠红、白髓分界不清,红髓充血,白髓淋巴细胞结构紊乱。黄芪组小鼠脾脏红、白髓分界尚可,凋亡淋巴细胞减少,红髓未见明显充血,结果见图1。

图1 照射后8 d小鼠脾脏病理切片图(HE染色,×50)

3 讨论

本实验结果表明,模型组小鼠的红细胞和血红蛋白与正常组相比显著下降(P<0.05),给药组小鼠的红细胞和血红蛋白与模型组相比显著升高(P<0.05)。说明5Gy X射线对Balb/c雄性小鼠的红细胞和血红蛋白均造成损伤,黄芪具有预防辐射损伤小鼠的红细胞和血红蛋白减少的作用。APS能使红细胞表面C3受体数量增加,红细胞的免疫水平增强[8]。

淋巴细胞是白细胞的主要组成成分,在Balb/c小鼠的外周血中,淋巴细胞约占白细胞的83%,是构成其免疫防御系统的要素之一[9]。对电离辐射最敏感的靶器官是细胞核,白细胞和淋巴细胞都有细胞核,对辐射极其敏感,辐射小鼠的白细胞和淋巴细胞急剧减少[10]。本实验结果表明,模型组小鼠的白细胞与正常组相比急剧下降(P<0.05);给药组小鼠的白细胞与模型组相比显著升高(P<0.05)。说明5Gy X射线对Balb/c雄性小鼠的白细胞造成损伤,中药黄芪具有预防辐射损伤小鼠的白细胞减少的作用。尹伟等[11]研究表明,APS可以协助红细胞对淋巴细胞的免疫调控作用,引起淋巴细胞数量增加和增殖功能增强。

血小板是血液中最小的细胞,但其止血的作用极为重要。血小板在血栓栓塞、炎症和免疫调节过程中起着关键作用[12]。本实验结果表明,与正常组相比,模型组小鼠的血小板显著下降(P<0.05);与模型组相比,给药组小鼠的血小板未见明显升高(P>0.05)。说明5Gy X射线对Balb/c雄性小鼠的血小板造成损伤,中药黄芪具有预防辐射损伤小鼠血小板减少的作用不明显。可能与血小板生存周期有关。

本实验结果表明,与正常组相比,模型组小鼠的脾脏、胸腺指数显著下降(P<0.05);与模型组相比,给药组小鼠的胸腺、脾脏指数未明显升高(P>0.05)。说明5Gy X射线对Balb/c雄性小鼠的胸腺、脾脏均造成损伤,中药黄芪对辐射小鼠的胸腺、脾脏的预防作用不明显。卢炜等[13]给予APS灌胃小鼠持续14 d。结果显示,黄芪多糖显著增大胸腺和脾脏指数。以上实验结果说明,APS可通过提高胸腺和脾脏指数来发挥免疫调节作用。

研究认为电离辐射是一种毒邪,故命名为电离毒,中医属“火热毒邪”范畴[14]。火为阳邪,煎熬津液,日久形成病理产物淤血,血液减少,进而导致红细胞、白细胞、血红蛋白、血小板等减少。火易耗气伤津,血液由脾脏运化的水谷和津液经心阳赤化而成,津液减少,血液生成不足,进而导致外周血细胞减少。总之,电离辐射导致生物体的气血津液俱虚,阴阳平衡失调。《医林改错》曰：“有形之血不能速生,无形之气所当急固”。比如：亡血证指血液大量亡失之证。病因可因误汗、误下等错误治疗导致气血亏损,亦可由于吐血、便血、尿血、妇人下血等失血量过多或久病不愈转化而来。由于阴阳互相依存,阴液耗伤过度,阳气失其所依而散越,患者出现虚脱的症状。病机主要分为营血不足与气血两虚两种。遵循急则治其标,缓则治其本的原则。针对急性失血患者,宜用大剂量的补气药。一方面可以固摄血液,防止出血;另一方面,气能生血,使阳气有所依附,防止虚阳外越。本实验Balb/c雄性小鼠受辐射后,外周血液急剧下降。据以上中医基础理论,选用“补药之长”的黄芪用于预防辐射损伤小鼠的白细胞、红细胞、血红蛋白等减少和脾脏、胸腺的损伤。