肝细胞癌患者血清长链非编码RNA LINC00673水平及其临床意义*

任虎虎,李 晨,陈 建,吴智群

空军军医大学唐都医院介入科,陕西西安 710032

原发性肝癌是一种起源于肝脏组织的恶性肿瘤,75%～85%为肝细胞癌(HCC)[1]。据2014年数据统计,肝癌分别位居我国恶性肿瘤发病谱、死亡谱的第4位、第2位[2]。肝癌早期症状不典型,不易被发现,确诊时常伴随肿瘤转移及相关并发症,预后总体较差[3]。因此,对肝癌的研究受到临床高度重视,寻找肝癌相关分子标志物,对于肝癌的病因诊断、治疗指导、预后评估有重要意义。肝癌形成机制复杂,除了与病毒性肝炎、饮酒、黄曲霉毒素等因素相关外,还涉及分子学机制[4]。长链非编码核糖核酸(lncRNA)是一类定位于细胞核或细胞质中且长度大于200个核苷酸的RNA分子,可参与基因表观遗传学表达调控,并在恶性肿瘤形成及进展过程中发挥重要作用[5]。lncRNA LINC00673为新近发现的lncRNA分子,定位于17q24.3上,在恶性肿瘤中呈异常表达[6]。但lncRNA LINC00673在肝癌中的确切表达情况少见报道,该分子能否作为血清标志物应用于HCC的临床诊治尚不明确。基于上述背景,本研究拟观察HCC患者血清lncRNA LINC00673水平变化情况及其与临床病理特征及预后的关系,以明确其临床意义,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2017年1月空军军医大学唐都医院收治并确诊的103例HCC患者为HCC组。HCC组中男86例,女17例;<60岁72例,≥60岁31例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期73例,Ⅲ～Ⅳ期30例;淋巴结转移26例;血管侵犯54例;肝硬化83例;微癌栓15例;肿瘤分化程度:中高分化80例,低分化23例;肿瘤最大径<3 cm 25例,≥3 cm 78例;血清甲胎蛋白(AFP)<400 μg/L 62例,≥400 μg/L 41例。纳入标准:(1)符合《肝细胞癌临床指南更新》中的相关诊断标准,经病理检查确诊[7];(2)术前未进行射频消融、肝动脉栓塞化疗、免疫治疗等医学干预;(3)无凝血功能障碍;(4)无精神系统疾病。排除标准:(1)合并其他恶性肿瘤;(2)临床资料不完整;(3)不配合研究要求;(4)认知功能不正常或无法正常沟通;(5)生命终末期;(6)妊娠期或哺乳期女性。另选择同期体检健康志愿者103例为对照组,其中男84例、女19例,<60岁69例、≥60岁34例。HCC组和对照组性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经空军军医大学唐都医院医学伦理委员会批准。所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清lncRNA LINC00673水平检测 收集受试者外周静脉血5 mL,室温环境下静置60 min,在4 ℃下以1 000 r/min离心10 min,收集上层血清并转至收集管后,再在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min,离心操作结束后于-80 ℃冰箱内冻存。采用TRIzolTMLS试剂盒(上海联硕生物科技有限公司)提取受试者血清中的总RNA,采用反转录试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)合成cDNA,cDNA模板按5倍稀释后置于-20 ℃冰箱内冻存。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行基因扩增,反应条件:95 ℃下30 s预变性,95 ℃下10 s变性,60 ℃下30 s退火延伸,循环40次。lncRNA LINC00673上、下游引物分别为5′-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3′与5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3′;内参GAPDH上、下游引物分别为5′-CTATGCAGCTCTTCTATGTGG-3′与5′-ATCCAACTGTGAATCAGCC-3′。lncRNA LINC 00673水平以2-ΔΔCt计算。

1.2.2随访情况 对103例患者进行5年门诊复查随访,2022年1月截止,统计患者总生存情况。第1年每3个月随访1次,从第2年开始每6个月随访1次,检查项目包括超声、电子计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)等。

2 结 果

2.1HCC组和对照组血清lncRNA LINC00673水平分析 RT-PCR结果显示,lncRNA LINC00673在HCC组血清中的水平(4.37±1.06)明显高于对照组(1.29±0.31),差异有统计学意义(t=28.303,P<0.001)。

2.2血清lncRNA LINC00673诊断HCC的ROC曲线分析 血清lncRNA LINC00673诊断HCC的曲线下面积(AUC)为0.783(95%CI:0.718～0.849),最佳截断值为2.87时,灵敏度为75.70%,特异度为81.61%,准确度为78.70%。见图1。

图1 血清lncRNA LINC00673诊断HCC的ROC曲线

2.3不同临床病理特征HCC患者血清lncRNA LINC00673表达情况比较 以ROC曲线最佳截断值2.87为分界点,将103例HCC患者分为lncRNA LINC00673低表达组(血清lncRNA LINC00673水平<2.87,41例)与lncRNA LINC00673高表达组(血清lncRNA LINC00673水平≥2.87,62例)。lncRNA LINC00673高表达患者血清AFP水平≥400 μg/L、肿瘤最大径≥3 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有血管侵犯、有淋巴结转移情况的比例明显高于lncRNA LINC00673低表达患者(P<0.05),而lncRNA LINC00673高表达患者和lncRNA LINC00673低表达患者在性别、年龄、肝硬化、肿瘤分化程度、微癌栓情况方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征HCC患者血清lncRNA LINC00673表达情况比较[n(%)]

2.4不同血清lncRNA LINC00673水平HCC患者的Kaplan-Meier生存曲线分析 103例HCC患者在随访5年间,失访6例,获得随访97例,其中生存53例,死亡44例,总生存率为54.64%。血清lncRNA LINC00673高表达组与lncRNA LINC00673低表达组5年总生存率分别为44.83%(26/58)、69.23%(27/39)。Kaplan-Meier生存曲线显示,血清lncRNA LINC00673高表达患者5年生存率显著低于lncRNA LINC00673低表达患者(Log-Rankχ2=6.007,P=0.014)。见图2。

图2 不同血清lncRNA LINC00673水平HCC患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

随着医疗技术的不断发展,手术切除、射频消融、肝动脉化疗栓塞、放射性疗法、分子靶向药物等手段应用于肝癌治疗,患者预后情况得到较大改善,但高复发与高转移仍制约着患者的长期生存。有报道称,肝癌患者根治性切除术后5年累积复发率可达70%,且复发肿瘤的侵袭性相较于原发肿瘤更高[8]。肝癌发病率较高,预后较差,对人类健康造成严重威胁。故寻找在肝癌早期诊断、病情评估、预后判断中具有潜在应用价值的分子标志物十分必要。

lncRNA是一种无蛋白质编码功能的RNA分子,能够参与基因组印记、X染色体沉默、转录激活、染色质修饰、核内运输等多个生命过程,还可参与调节细胞增殖和凋亡[9]。多项研究提示,在肝癌发病过程中,lncRNA起促进作用[10-11]。lncRNA LINC00673为lncRNA家族中的一种,在不同癌组织中存在高或低表达,在恶性肿瘤诊断或预后评估方面具有潜在优势[12]。本研究显示,lncRNA LINC00673在HCC组血清中的水平明显高于对照组,提示lncRNA LINC00673在HCC中呈高表达,该分子可能参与了HCC发生。以往研究也提示恶性肿瘤的形成可能与lncRNA LINC00673有关,如李涛等[13]和高勇等[14]检测结肠癌和胃癌患者癌组织中lncRNA LINC00673的水平,并与其对应的癌旁正常组织作对照研究,发现癌灶组织内lncRNA LINC00673水平明显更高。本研究显示血清lncRNA LINC00673诊断HCC的AUC为0.783(95%CI:0.718～0.849),最佳截断值为2.87时,灵敏度为75.70%,特异度为81.61%,准确度为78.70%,提示血清lncRNA LINC00673对于HCC有一定的诊断价值,有望作为HCC的辅助诊断指标。此外,本研究发现lncRNA LINC00673高表达患者血清AFP水平≥400 μg/L、肿瘤最大径≥3 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有血管侵犯、有淋巴结转移情况的比例明显高于lncRNA LINC00673低表达患者(P<0.05),提示血清lncRNA LINC00673与HCC临床病理特征关联密切,该分子可能参与了HCC迁移、侵袭等癌细胞进展。郭红艳等[15]报道,lncRNA LINC00673高表达能促进磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径关键分子表达,上调肿瘤相关因子zeste基因增强子同源物2(EZH2)和β-catenin水平,继而促进胃癌MGC-803细胞增殖和克隆。ZHANG等[16]研究提示,lncRNA LINC00673沉默对抑制肝癌细胞上皮-间充质转化及增殖、侵袭有积极作用。本研究103例HCC患者随访5年间,失访6例,Kaplan-Meier生存曲线显示血清lncRNA LINC00673高表达患者5年生存率显著低于lncRNA LINC00673低表达患者,提示血清lncRNA LINC00673高表达与HCC不良预后有关。ZHANG等[17]和张依等[18]的研究与此相符。ZHANG等[17]发现lncRNA LINC00673高表达与胰腺癌患者存活率下降有关,可作为该肿瘤预后的标志物。张依等[18]提到,lncRNA LINC00673水平上升与肺癌预后不良相关。进一步分析可能原因为lncRNA LINC00673通过与组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)和果蝇EZH2相互作用,进而促进HCC的发生和发展,导致其预后不良[19]。

综上所述,HCC患者血清lncRNA LINC00673水平升高,其水平与患者肿瘤最大径、TNM分期、血管侵犯、淋巴结转移、血清AFP水平有关,可导致预后不良,有望成为HCC诊疗相关的血清标志物。但其具体机制不明,有待细胞学实验或动物模型实验进一步验证。