大豆异黄酮检测方法研究进展

何继红，郝霖雨，朱高群

1.中牧农业连锁发展有限公司，北京 100700；2.中牧实业股份有限公司，北京 100700

随着人类对食品安全的日益重视，生产优质的动物源食品，是畜牧业健康发展的主要方向。开发新型绿色饲料添加剂，一直是研究热点。其中中草药及天然植物的代谢产物，因其天然和安全备受青睐。大豆异黄酮（soy isoflavones，SI）是豆科植物的次生代谢产物，为黄酮类物质，结构类似于雌激素，具有双向雌激素作用，即类雌激素作用和抗雌激素作用。大豆异黄酮可增强免疫力、提高动物繁殖性能，促进动物生长，用其对动物进行试验的研究一直方兴未艾。畜牧生产研究表明，大豆异黄酮作为饲料添加剂具有剂量小、见效较快等特点，具有广阔应用前景。但是由于其抗雌激素作用，临床上使用应注意饲料组成、添加时机、添加剂量和持续时间，避免不良反应的发生发展。因而，有必要建立高效快捷的检测方法。笔者通过查阅文献资料，发现针对动物血浆、肉、蛋及饲料中SI 的检测方法近乎空白。为了合理使用SI，避免不良效果，本文对当前的SI检测方法做一综述，以飨读者。

1 理化分析方法

理化分析方法一般可以进行定量定性分析，如毛细管电泳法、色谱法及其联用技术等。而色谱法为常用的检测方法，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱联用技术等。目前，可知大豆异黄酮含有3 种游离型异黄酮苷元和9 种结合型异黄酮糖苷。发挥生理作用的为游离型异黄酮苷元，包括大豆黄酮、染料木素和黄豆黄素，结合型异黄酮经肝脏代谢后，在小肠中，水解为游离型，可被再吸收。因而，SI 的检测方法多为多组分分析。

1.1 毛细管电泳法

毛细管电泳法具有极高的分离效能，其原理是待测物在电场力的作用下运动，从而达到分离检测的目的。Luan 等[1]2017 年采用细管区带电泳法同时测定咖啡中大豆苷、染料木素和芒柄花素。样品用丁酰甲酚酸水解后，用乙醚进行提取和纯化。三种化合物均能在10 min 内完成检测，线性范围为0.5～50 μg/mL。大豆苷元、芒柄花素和染料木素的检测限分别为0.064 2、0.134 0 和0.082 5 μg/mL。本方法的优点是高效，但是制备繁琐，重现性差，因而本方法未成为主流检测方法。

1.2 HPLC 方法

液相色谱仪一经问世，就以快捷高效分离、定量半定性分析等优势，取得了长足发展。其检测器有紫外、荧光和二极管阵列，并可与质谱（MS）进行联用。近年来，超高效色谱技术（UPLC）更是突飞猛进，极大提升了检测效率。大豆异黄酮作为极性物质，其母核为3-苯并吡喃酮，含有2 个苯环，因此具有强烈的紫外吸收，可进行HPLC 检测（母体分子结构见图1）。

图1 SI 的母体结构

1）单组分检测方法。我国2010 年颁布了国标GB/T 25174-2010《饲料添加剂4′，7 二羟基异黄酮》，可以检测化学合成的大豆黄酮含量。本方法是以85%的乙醇溶液为提取溶液，超声5 min，紫外检测器检测。该方法操作简单，操作容易，标准中只是规定了原料药的检测，未给出定量限和检测限。如果检测饲料或者动物源食品中的SI 含量，需要对该方法进一步研究。

2）多组分检测方法。由于SI 中含有多个组分，因而其方法一般为多组分分析方法。胡莉等[2]2017 年建立的HPLC 方法，可测定粮食中6 种大豆异黄酮(大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素)。大豆异黄酮各组分浓度在0.2～50 μg/mL 范围内呈良好的线性关系(r＞0.999)，平均加标回收率为96.9%～107.8%，检出限为0.03～0.1 μg/mL，定量限为0.1～0.3 μg/mL。本研究采用了不同浓度的甲醇和丙酮作为提取溶液，结果表明，80%甲醇和90%甲醇提取效果最佳，相对偏差也最小，提取率最高最稳定。实验方法是样品粉碎后过筛，80%甲醇溶液，超声提取30 min，取上清液，过滤后上机。采用Thermo Syncronis C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.5%甲酸水溶液、乙腈和甲醇作为流动相进行梯度洗脱，流速0.8 mL/min，柱温为35 ℃，于紫外检测器波长260 nm 处检测。杨子秋[3]等于2018 年建立了HPLC 法测定保健食品中4 种大豆异黄酮的含量：大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素。大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素平均回收率分别为101.61%、100.11%、101.95%、101.21%。本方法是采用Phenomenex Syneisi Fusion-RP80（4 μm，4.6×150 mm）色谱柱，柱温30 ℃，以乙腈-水（pH 值为3.0）梯度洗脱。流速1.0 mL/min，检测波长260 nm。4种大豆异黄酮的标准曲线线性良好（r＞0.9999，n=7），该实验分别用甲醇、80%甲醇、50%甲醇3 种溶液作为提取溶液试验，结果表明以甲醇提取效果最佳，50%甲醇提取效果次之，80%甲醇提取效果最差。本研究还对超声提取时间进行了考察：超声处理30 min 与40 min，提取效果无差异，而与超声处理20 min 提取效果差异显著。本研究还考察了Shimadzu LC20A 高效液相色谱仪与Agilent1100 型液相色谱仪分别搭配Synersi Fusion-RP 80（4 μm，4.6×150 mm）色谱柱与Waters Symmetry-C18（5 μm，4.6×150 mm）色谱柱，在本实验条件下分别测定同一样品的情况，色谱柱不同样品保留行为有差异，但测定结果一致。马翛然等[4]2018 年建立了可同时测定大豆和大豆制品中黄豆黄素、黄豆黄苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鸢尾黄酮苷和鹰嘴豆芽素A 共8 种异黄酮含量的HPLC 方法。以甲醇水溶液提取异黄酮，经C18 固相萃取柱净化，梯度洗脱，加标回收率为79.3%～102.5%。本研究对波长、色谱柱、流动相、提取溶液（不同比例的甲醇水）和超声时间进行了考察。结果表明254 nm 波长时，测定灵敏度最高；SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱效果最佳，选择90%甲醇水作为提取溶液；提取方式为超声30 min。吴俊发等[5]2021 年建立超高效液相色谱法(UPLC)同时测定保健品中大豆苷、染料木苷、染料木素和大豆素4 种大豆异黄酮的分析方法。方法检出限为0.5～1.0 mg/kg，方法定量限为1.5～3.0 mg/kg。固体样品粉碎后，以80%甲醇溶液，涡旋混匀后超声提取20 min。离心取上清液测定。油状液体胶囊样品取1 mL 于-18 ℃冰箱冷冻3 h 后过膜上机测定。色谱柱为Xbridge BEH C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；进样体积：10 μL；流速0.5 mL/min；柱温：40 ℃；测定波长：260 nm；流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸(V/V)(B)；梯度洗脱。

上述研究，均采用HPLC 反向色谱技术，检测波长介于250～260 nm，为多组分测定，采用梯度洗脱程序。提取溶液多选择80%～90%甲醇水，但是杨子秋研究表明80%的甲醇水提取效果最差，究其原因可能为样品来源不同。色谱技术对不同基质的样品，有不同的提取净化要求。如果基质简单，可直接使用有机溶剂进行处理，但是基质复杂或者组分含量偏低，就需采用相适应的净化富集技术，如马翛然的研究有发酵类产品，就采取了C18 固相萃取技术。

1.3 LC-MS 方法

LC-MS 方法是基于液相和质谱的联用技术，集高效分离和结构鉴定于一体，通过质谱图的解析确证检测物是否为目标物。Li 等[6]建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS-MS)方法检测大鼠血浆中的大豆黄酮和染料木素，定量限分别为2.0 ng/mL和10.0 ng/mL。贺显书[7]于2021 年建立了检测大豆中大豆异黄酮含量的UPLC-MS/MS 分析方法。6 种大豆异黄酮（大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、染料木素、大豆黄素、大豆黄酮），分别在0.01～0.5 mg/L 和0.002～0.1 mg/L 范围内有良好的线性关系，定量限为0.1 mg/kg。平均回收率为86.6%～96.2%。本方法是以90%的甲醇水溶液作为提取液，60 ℃超声波仪中提取30 min，在离心机中以15 000 r/min 离心5 min，取上清测定。色谱条件：Waters BEH C18（1.7 μm，50 mm×2.1 mm）色谱柱；质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子扫描（ESI+）；检测方式为多反应监测模式(MRM)；毛细管电压为3.0 kv；去溶剂气温度为450 ℃；去溶剂气流量为800 L/h。

如果样品中SI 含量较低或基质复杂，则可采用质谱技术。研究发现同浓度的大豆异黄酮在质谱检测器上的响应值要远远超过紫外检测器。质谱法还可以通过选定目标物特征离子实现高选择性，能有效避免杂质对峰型的干扰，有利于定性定量。但是质谱技术具有设备较为昂贵，环境和操作人员要求较高的缺点。

2 免疫学分析方法

免疫学分析方法是以药物的单克隆抗体或多克隆抗体为核心试剂，以酶为反应介质的快速筛选方法。该方法的特点为特异、灵敏、简便、快捷，适用于大量样品的检测，从而在药物分析方法中占有一席之地。常见免疫分析方法有酶联免疫检测(ELISA)方法、生物传感器、荧光免疫方法等。ELISA 方法是当前应用最广、发展最快的固相酶免疫测定技术，一般将抗原或抗体包被于微孔板，酶标抗原或抗体与样本反应竞争包被物，通过底物显色进行目测或分光光度测定。王贵升[8]2002 年建立了检测大豆黄酮的ELISA 方法，检测灵敏度是100 ng/mL，线性范围是100～4 000 ng/mL，并利用该方法检测了大鼠血清、鸡蛋以及大鼠饲料和鸡饲料中的犬豆黄酮。

3 结语

综上所述，近年来，大豆异黄酮的检测方法多集中于HPLC 检测方法，HPLC-MS 方法也有所增加。但是关于免疫学分析方法的研究仅在2002 进行过。在畜牧业养殖实践中，可以考虑研发ELISA试剂盒，进行大量样本的检测工作，同时建立专属的动物机体和饲料中SI 的检测方法。