连翘酯苷A对肝星状细胞增殖及凋亡的影响*

刘 蓉，唐 斌，刘漪沦，谭悦浩，李 灿，胡 雪，沈昊天，邓峰美△

1.成都医学院 基础医学院（成都 610500）；2.成都医学院第一附属医院（成都 610500）；3.雅安市名山区人民医院（雅安 625000）

肝纤维化是肝硬化和肝癌的必经阶段，由肝内结缔组织异常增生形成。病毒性肝炎、酒精性或肥胖相关的脂肪性肝炎、寄生虫病、代谢性疾病、自身免疫性肝病等均可引起慢性肝损伤，导致肝脏炎症和纤维化[1]。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）驻留在血管内皮下间隙，在各种损伤因素下可被激活，使之活化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，从而产生瘢痕组织[2]。在肝脏疾病中，HSCs的激活是肝纤维化发展的关键步骤。在生理情况下，HSCs处于静息状态；当受到各种损伤因素刺激时，肝脏中的细胞（肝细胞、枯否细胞等）释放大量细胞因子作用于静止状态的HSCs，使其活化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是以表达丰富的细胞内蛋白为特征，包括波形蛋白、平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，α-SMA）和α1-Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠalpha1，COL1A1）等，而ECM的主要成分又是I型胶原蛋白，实验中常把α-SMA和COL1A1 蛋白作为体外肝纤维化的标志物[3]。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是肝脏中关键的有丝分裂原，可激活HSCs[4-5]，增加α-SMA的表达，而PDGF-BB是其中最强的丝裂原，因此在实验中常采用PDGF-BB来激活HSCs，模拟体内肝纤维化微环境。

细胞凋亡、坏死和自噬性死亡均会触发细胞死亡[6]，可作为介导HSCs的靶点。研究[7]表明，抑制HSCs增殖、激活或诱导HSCs衰老和凋亡，阻断ECM的过度沉积，可有效改善肝纤维化[8-9]。慢性肝损伤后，肝细胞发生凋亡，导致HSCs活化、增殖并导致炎症和纤维化反应，因此抑制肝细胞凋亡被认为是肝纤维化治疗的重要策略[10]。

长期肝损伤引起的肝纤维化和肝硬化是全球卫生保健的主要负担之一，迄今为止，肝移植仍然是失代偿性肝病的主要治疗方法[11]。近年来随着肝病发病率的逐年上升，急需研发高效、毒性较小的新药物，中药因作用靶点多、副作用小、毒性低等特点备受关注。连翘酯苷A（forsythiaside A，FA）是从连翘的风干果实中分离出来的一种苯乙醇苷类物质，具有多种生物学功能，如抗炎[12]、抗氧化[13]、抗病毒感染[14]等。近年来研究[15]发现，FA具有保肝作用，FA可通过PI3K/AKT介导细胞凋亡，改善乙酰氨基酚诱导的斑马鱼肝损伤；FA通过调节肠道微生物组群从而减轻四氯化碳诱导的肝纤维化[16]。FA可预防过氧化氢诱导的线粒体依赖性PC12 细胞凋亡[17]。FA还可通过抗炎和抗凋亡作用改善脓毒症诱导的急性肾损伤[18]。目前，FA对LX-2 细胞凋亡及改善肝纤维化的作用机制尚未完全阐明，因此本研究拟探索FA对人肝星状细胞增殖活化及凋亡的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞

采用人源肝星状细胞（LX-2）为实验对象，LX-2细胞株购自武汉普诺塞公司，于无菌培养箱中培养（37 ℃、5%CO2）。每天观察细胞密度及形态，待培养基颜色发生变化时更换细胞培养液，后续进行油红O染色、蛋白质印迹技术等实验。

1.2 主要试剂

杜氏改良高糖培养基（货号：11965092）、胎牛血清（货号：10100147）、0.25%胰蛋白酶（货号：25200072）、青链霉素双抗（货号：15070063）购自美国Gibco公司；FA（货 号：HY-N0028）、PDGF-BB（货 号：HY-P7055）购自美国MCE公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（货 号： C1002） 、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（货号：A0423）购自北京碧云天生物技术有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（货号：CA1020）、油红O染色试剂盒（货号：G1262）购自北京索莱宝公司；兔多克隆抗体α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（货号：19245）、α1-I型胶原蛋白（collagen type I alpha1，COL1A1）（货号：72026）、腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（货号：9532）、B淋巴细胞瘤-2 蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）（货号：4223）、BCL-2 相关X蛋白（BCL-2-associated X protein，BAX）（货号：41162）、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-CASPASE3）（货号：9664）、甘油醛-3-磷酸脱氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（货号：5174）和HRP偶联的抗兔IgG抗体（货号：7074）购自美国CST公司。

1.3 检测LX-2 细胞活力

当LX-2 细胞密度达到80%～90%时，用胰蛋白酶进行消化并收集细胞，然后进行细胞计数。在96 孔细胞培养板中以3×103个/孔的密度接种，每组接种6个复孔，放入培养箱培养；次日，加入不同浓度（0.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0 μmol/L）的FA处理；24 h后每孔加入10 μL的细胞计数（cell counting kit-8，CCK-8）试剂；在37 ℃的条件下孵育1 h；在酶标仪上选择波长为450 nm条件下测定吸光度值，并计算6 孔的平均值。

1.4 油红O 染色

将细胞爬片放入24 孔细胞培养板中，将LX-2 细胞以5×104个/孔的密度接种至孔内，将细胞分为4组：二甲基亚砜（dsulfoxide，DMSO）组、PDGF-BB组、FA组、PDGF-BB+FA组，采用40 μg/L PDGF-BB和100 μmol/L FA处理细胞，作用24 h，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗5 min×3次；用10%中性甲醛室温固定10 min；用PBS洗涤1 min×1次，然后用60%异丙醇处理15 s；在37 ℃避光环境下用已过滤的油红O染液对细胞爬片染色；用60%异丙醇处理细胞15 s；用PBS洗涤3 min×3 次；用苏木素染液对细胞进行复染、甘油封片；在光学显微镜下观察染色结果并拍照。

1.5 蛋白质印迹技术

将4 组细胞用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液在冰上裂解，离心后取蛋白上清液，用BCA法测定蛋白浓度，加入Loading Buffer制备蛋白样品；样品加入SDSPAGE凝胶进行电泳，转膜后，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h；加一抗4 ℃孵育过夜，三乙醇胺缓冲盐吐温溶液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜5 min×3 次；加二抗室温孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次；采用凝胶成像仪进行曝光并拍照。

1.6 免疫荧光染色

在细胞爬片上进行细胞培养，FA 处理24 h 后，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS漂洗5 min；0.1%的Tritonx-100处理15 min；PBS漂洗5 min；5%山羊血清室温封闭1 h；4 ℃孵育一抗（α-SMA）过夜；恢复至室温，PBS漂洗细胞；使用荧光二抗Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗；DAPI染核5 min，PBS漂洗3 min×3次；用防荧光淬灭剂封片，使用光学显微镜（日本Olympus公司，型号：BX-63）观察细胞形态并拍照，全程避光操作。

1.7 流式细胞仪检测

收集4 组细胞，用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化细胞，1000 r/min，离心半径5 cm，离心5 min，沉淀细胞，吸除上清，加入1 mL 4 ℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀，小心吸除上清。按照说明书加入Annexin V-FITC和碘化丙锭溶液（propidium iodide，PI）；最后使用流式细胞仪检测FA对LX-2 细胞凋亡的影响。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0 统计软件进行数据分析，定性资料采用例数（%）表示，定量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用Dunnett's t检验。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 FA 对LX-2 细胞增殖活化的影响

CCK-8 实验结果显示，不同浓度的FA（0.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0 μmol/L）处理后，LX-2 细胞活力降低，且呈剂量依赖性。油红O染色结果显示，PDGF-BB组细胞中脂滴较少，而FA组和PDGF-BB+FA组细胞中脂滴较多（图1、表1）。

表1 LX-2 细胞在不同浓度FA处理下的细胞活力分析（，n=3）

表1 LX-2 细胞在不同浓度FA处理下的细胞活力分析（，n=3）

注：与0 μmol/L比较，*P＜0.05。

浓度/（μmol/L）增殖率/%0.0100.00±0.0012.5100.00±0.4625.098.67±1.0250.096.47±0.64*75.094.57±1.40*100.087.98±1.07*150.078.79±1.76*200.066.37±1.31*F 366.800 P＜0.001

2.2 FA 对肝纤维化相关指标的影响

蛋白质印迹技术检测结果显示，与对照组相比，PDGF-BB组α-SMA和COL1A1蛋白表达明显增加，而FA组和PDGF-BB+FA组α-SMA和COL1A1蛋白表达明显降低。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，PDGF-BB组α-SMA表达明显增加，而FA组和PDGF-BB+FA组α-SMA表达明显低于PDGF-BB组（图2、表2）。

表2 4组细胞α-SMA、COL1A1蛋白表达情况比较（，n =3）

表2 4组细胞α-SMA、COL1A1蛋白表达情况比较（，n =3）

注：与DMSO组相比，*P＜0.05。

组别α-SMACOL1A1 DMSO组1.00±0.001.00±0.00 PDGF-BB组0.93±0.011.96±0.43*FA组0.63±0.11*1.03±0.13 PDGF-BB+FA组0.54±0.22*1.18±0.11 F 6.8667.897 P 0.0470.037

图2 FA对肝纤维化相关指标表达的影响

2.3 FA 对LX-2 细胞凋亡的影响

蛋白质印迹技术结果显示，与对照组相比，FA组和PDGF-BB+ FA 组cleaved-PARP、BAX 和cleaved-CASPASE3蛋白表达增高，同时BCL-2 蛋白表达降低（图3、表3）。流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，PDGF-BB组细胞发生凋亡的比例减少，而FA组细胞发生凋亡的比例明显增多（图4）。

表3 4 组细胞凋亡相关蛋白的表达比较（，n =3）

表3 4 组细胞凋亡相关蛋白的表达比较（，n =3）

注：与DMSO组相比，*P＜0.05。

组别cleaved-PARPBCL-2BAXcleaved-CASPASE3 DMSO组1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 PDGF-BB组0.73±0.371.01±0.110.63±0.17*0.83±0.05*FA组2.21±0.36*0.44±0.15*1.35±0.03*1.35±0.00*PDGF-BB+FA组2.36±0.11*0.45±0.16*1.32±0.03*1.29±0.07*F 20.17020.59029.39063.040 P 0.0070.0010.0040.001

图3 FA对LX-2 凋亡相关蛋白的影响

图4 流式细胞仪检测FA对LX-2 细胞凋亡的影响

3 讨论

肝纤维化广泛存在于多种肝脏疾病的病理过程中，在各种损伤因素刺激的情况下，静息状态的HSCs活化为肌成纤维细胞，并合成大量ECM，ECM过度沉积导致肝纤维化[1]。HSCs是肌成纤维细胞最主要的细胞来源，HSCs的活化被称为是纤维化发生的核心环节[3]。

PDGF最初发现于血小板中，是肝星状细胞活化的关键分子，而PDGF-BB亲和力更强[19-20]，因此本研究选择PDGF-BB作为HSCs的激活剂，模拟体内肝纤维化的微环境，使HSCs处于激活状态。本研究发现，FA可使细胞活力降低，抑制LX-2细胞的增殖。LX-2细胞在静息状态下富含多个储存维生素A的脂滴，而在激活状态下细胞内脂滴丢失。本研究结果显示，PDGF-BB能使细胞中脂滴数量减少，LX-2细胞呈活化状态；FA能使细胞中脂滴数量增加，LX-2细胞呈静息状态，表明FA不仅可抑制LX-2细胞的活化，还可使已经活化的LX-2细胞恢复静息状态。PDGF-BB可使LX-2细胞中α-SMA和COL1A1蛋白表达增多，而FA处理后LX-2细胞中α-SMA和COL1A1蛋白表达均降低，表明FA可使LX-2细胞不活化为具有肌成纤维表型的细胞，从而改善PDGF-BB诱导的体外肝纤维化。

凋亡是细胞在特定的情况下，本身发生的主动性、程序性死亡[21-22]。研究[23]表明，正常情况下大多数肌成纤维细胞在修复完成后会主动发生凋亡，但是在慢性肝病中，活化的HSCs可通过旁分泌和自分泌细胞因子的作用来逃逸凋亡，加重肝纤维化，最终进展为肝硬化。研究[24-25]表明，黄芪素、卡维地洛通过促进肝星状细胞凋亡来减轻肝纤维化。活化的HSCs发生凋亡，可改善肝纤维化的发展，因此调控HSCs 凋亡是研究肝纤维化的关键靶点。为了进一步研究FA是否能够诱导LX-2凋亡的发生，本研究对细胞凋亡进行检测发现，PDGF-BB作为HSCs的激活剂可抑制LX-2细胞凋亡，而FA可促进LX-2细胞凋亡。

综上所述，FA可抑制LX-2 细胞的增殖活化，促进细胞凋亡，改善体外PDGF-BB诱导的肝纤维化。本研究存在一定不足，未探讨FA促进肝星状细胞凋亡的具体作用靶点以及FA在体内的作用，未来研究中还需要进一步深入研究。