木兰脂素调控Fyn-STAT5通路治疗变应性鼻炎*

张晓芳,刘慧娜

郑州市骨科医院,河南 郑州 450052

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又称为过敏性鼻炎,是指特应性个体在接触变应原后出现的一种非感染性鼻部炎性疾病,主要有免疫球蛋白E介导包含组胺在内的介质释放,且多种免疫活性细胞和细胞因子均有参与[1]。报道指出,AR可参与多种疾病发生,如结膜炎、腺样体肥大、哮喘等,甚至可导致劳动力丧失,已成为全球性的健康问题[2]。氯雷他定是AR患者常用的抗组胺药物,可控制过敏症状,减轻病情[3]。大量的现代研究与临床实践证明,中医药干预治疗变应性鼻炎效果显著[4-6],木兰脂素是中药材辛夷的提取物,在既往报道中证实有抗炎、抗过敏作用[7],但该药物对AR是否有效尚需进一步探讨。研究指出,鼻黏膜成纤维细胞主要参与特应性个体接触变应原后的免疫反应[8],包括速发相反应和迟发相反应,出现相应炎症反应病理表现,且组胺、白三烯、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等均可参与上述反应。另有报道显示,致密物酪氨酸激酶(dense tyrosine kinase Fyn,Fyn)/信号转导和转录激活因子5(signal transducers and activators of transduction 5,STAT5)通路可参与鼻黏膜成纤维细胞免疫活性的调节[9],介导多种细胞因子的合成与分泌,包括SCF、IL-10等,推测调控AR鼻黏膜成纤维细胞Fyn-STAT5信号通路可调节SCF、IL-10表达,控制特应性个体接触变应原后的免疫反应,减轻鼻黏膜组织病理损伤。但木兰脂素是否可通过调控Fyn-STAT5信号通路治疗AR尚不明确。鉴于此,本研究特设计动物实验探讨上述问题,以期为AR临床治疗的新药开发提供方向。

1 材料

1.1 实验动物58只豚鼠,清洁级,雌雄各半,3月龄,体质量200～250 g,购自上海斯莱克实验动物公司,生产许可证号:SCXK(沪)2019-0010,使用许可证号:SYXK(沪)2019-0046。饲养环境:通风、无噪声、12 h光照/12 h黑暗,温度15～28 ℃,湿度50%～60%。本研究经郑州市骨科医院实验动物伦理委员会审批,审批号:ZZSGKYY20210415。

1.2 药物与试剂卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)粉末、氢氧化铝(美国Sigma公司,批号:A5253S、199974-1KG);卵清白蛋白溶液(2%浓度,北京百奥莱博科技有限公司,批号:GS4343);木兰脂素(成都圣露药业有限公司,经高效液相色谱法鉴定纯度>98%,批号:BJR4713);氯雷他定[拜耳医药(上海)有限公司,批号:国药准字H10970410,规格:10 mg];苏木素-伊红染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,批号:M161317);Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司,批号:R1030);逆转录试剂盒(美国Gene Copoeia公司,批号:K20511);引物序列委托中国上海生工生物工程技术服务有限公司合成;蛋白提取试剂盒(美国Bio-Rad公司,批号:P1259178);兔抗鼠Fyn、STAT5、SCF、IL-10单克隆抗体,山羊抗兔Fyn、STAT5、SCF、IL-10多克隆抗体(美国Maxim生物技术公司,批号:M20135、M20196、M20823、M20266、M20239、M20288、M21145、M21152)。

1.3 仪器CX41型光学显微镜、CKX 53型倒置相差显微镜(日本Olympus公司);UC7型组织切片机(德国Leica公司);7300型PCR仪(美国ABI公司);E8015-C1型转膜仪、PowerPac Basic型电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 动物分组、建模与干预将58只豚鼠采用随机数字表法分为建模组(n=50)、空白组(n=8)。建模组采用OVA抗原混悬液全身及局部攻击建立AR模型[10],具体如下:卵清蛋白粉末0.3 mg+氢氧化铝30 mg溶于1 mL生理盐水中制成混悬液作为基础致敏制剂,每隔1天进行腹腔注射,每次 1 mL,共4次。末次基础致敏次日改为局部攻击致敏,取2%卵清白蛋白溶液攻击双侧鼻腔,每侧 50 μL,每天1次,共7次。空白组仅予以等量生理盐水和双侧鼻腔攻击。干预后观察豚鼠30 min内鼻部症状,包括抓鼻、流涕、喷嚏,并分别进行计分,其中轻度计1分、中度计2分、重度计3分,各症状总分≥5分则认为建模成功。将建模成功的48只豚鼠随机分为模型组8只、氯雷他定组10只、木兰脂素低剂量组10只、木兰脂素中剂量组10只、木兰脂素高剂量组10只。木兰脂素低、中、高剂量组大鼠分别予以20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、80 mg·kg-1的木兰脂素溶液灌胃,氯雷他定组大鼠予以1.05 mg·kg-1氯雷他定溶液灌胃,模型组和空白组仅予以等体积生理盐水灌胃,灌胃体积为10 mL·kg-1,每天1次,连续7 d。

2.2 鼻黏膜组织病理变化观察干预完成后取各组豚鼠部分鼻黏膜组织,固定,系列浓度酒精脱水,包埋,切片(层厚4 μm),HE染色,封片,光镜下观察鼻黏膜组织疾理变化。

2.3 鼻黏膜成纤维细胞分离并鉴定干预完成后,取各组豚鼠部分鼻黏膜组织,剪碎后消化,每1 h收集1次上清液并更换新的胶原酶溶液,重复4次。将收集的上清液经细胞筛(200目)过滤,1 000 r·min-1离心5 min,以含10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养液重悬,并接种至25 cm3细胞培养瓶。细胞培养后除去杂质和细胞碎片,进行传代培养,取第3代细胞于倒置相差显微镜下观察鉴定,并以免疫细胞化学法检测大鼠波形蛋白表达。

2.4 鼻黏膜成纤维细胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10mRNA表达检测参照文献[11],采用25 μg·L-1TGF-β1处理各组经过鉴定的鼻黏膜成纤维细胞,以5×104mL-1浓度接种于96孔板中,培养72 h。采用试剂盒抽提总RNA,并测定其浓度,逆转录为cDNA。采用Primer 6.0软件设计引物序列,引物信息见表1。配置PCR反应体系,共20μL。采用PCR仪进行扩增,步骤如下:50 ℃反应2 min,40个循环:95 ℃反应2 min、95 ℃反应30 s、60 ℃反应30 s,最后54 ℃反应5 min。根据内参基因和各目基因的Ct值计算目的基因相对表达量,公式:2-△△Ct。

表1 引物信息

△△Ct=(实验样品目的基因Ct-内参基因Ct)-(对照样品目的基因Ct-内参基因Ct)

2.5 鼻黏膜成纤维细胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10蛋白表达水平检测细胞增殖、培养和接种操作均同上。提取总蛋白,加上样缓冲液并进行沸水浴使其变性,测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE电泳凝胶,转膜后封闭。加入一抗(稀释比例均1500),4 ℃ 摇床孵育过夜;加入二抗(稀释比例均为12 000),室温孵育1～2 h。ECL显色,显影成像。采用Image Lab 4.0软件分析蛋白条带,计算目的蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 各组豚鼠干预前后鼻部症状评分比较氯雷他定组、木兰脂素高剂量组在给药期间各有1只豚鼠灌胃时穿破食管致死。最终氯雷他定组及木兰脂素高剂量组的样本量均为9只。

与干预前相比,干预后模型组豚鼠鼻部症状评分升高,氯雷他定组和木兰脂素低剂量组、木兰脂素中剂量组、木兰脂素高剂量组豚鼠鼻部症状评分均下降;且干预后氯雷他定组和木兰脂素低剂量组、木兰脂素中剂量组、木兰脂素高剂量组豚鼠鼻部症状评分均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组豚鼠干预前后鼻部症状评分比较 分)

3.2 各组豚鼠鼻黏膜组织病理改变空白组豚鼠鼻黏膜上皮组织及黏膜下组织和腺体结构整齐,未见充血、增生及炎性改变;模型组豚鼠鼻黏膜可见大量上皮组织脱落和坏死,上皮组织下有大量炎性细胞浸润,黏膜下腺体数量增多,有严重扩张,小血管有严重充血;木兰脂素低剂量组鼻黏膜可见部分上皮组织脱落和坏死,上皮组织下有明显炎性细胞浸润,黏膜下腺体数量增加,有腺体扩张,小血管有充血;木兰脂素中剂量组和氯雷他定组鼻黏膜可见少部分上皮组织脱落和坏死,上皮组织下有炎性细胞浸润,黏膜下腺体数量增加,腺体扩张;木兰脂素高剂量组鼻黏膜可见轻微上皮组织脱落和坏死,上皮组织下有轻微炎性细胞浸润,黏膜下腺体数量少量增加并扩张。见图1。

3.3 各组豚鼠鼻黏膜成纤维细胞病理改变倒置相差显微镜下可见空白组细胞形态均匀,多呈长梭形,均匀分布,且呈放射状或鱼群状排列;模型组、氯雷他定组、木兰脂素低剂量组、木兰脂素中剂量组、木兰脂素高剂量组成纤维细胞形态与空白组基本一致,但形态稍有改变,梭形长度变短且排列稍有杂乱。免疫细胞化学法检测显示各组细胞中波形蛋白均呈强阳性表达,且定位于细胞胞浆。见图2—图3。

注:A:空白组;B:模型组;C:氯雷他定组;D:木兰脂素低剂量组;E:木兰脂素中剂量组;F:木兰脂素高剂量组

注:A:空白组;B:模型组;C:氯雷他定组;D:木兰脂素低剂量组;E:木兰脂素中剂量组;F:木兰脂素高剂量组

3.4 各组鼻黏膜成纤维细胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10mRNA表达水平比较模型组FynmRNA、SCFmRNA表达水平均高于空白组,氯雷他定组和木兰脂素低剂量组、木兰脂素中剂量组、木兰脂素高剂量组FynmRNA、SCFmRNA均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组STAT5mRNA、IL-10mRNA表达水平均低于空白组,氯雷他定组和木兰脂素低剂量组、木兰脂素中剂量组、木兰脂素高剂量组STAT5mRNA、IL-10mRNA表达水平均高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组鼻黏膜成纤维细胞Fyn mRNA、STAT5 mRNA、SCF mRNA、IL-10 mRNA表达水平比较

3.5 各组鼻黏膜成纤维细胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10蛋白表达水平比较模型组Fyn、SCF蛋白表达水平均高于空白组,氯雷他定组和木兰脂素低剂量组、木兰脂素中剂量组、木兰脂素高剂量组Fyn、SCF蛋白表达水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组STAT5、IL-10蛋白表达水平均低于空白组,氯雷他定组和木兰脂素低剂量组、木兰脂素中剂量组、木兰脂素高剂量组STAT5、IL-10蛋白表达水平均高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4、图4。

注:BC组:空白组;M组:模型组;LO组:氯雷他定组;MOL组:木兰脂素低剂量组;MOM组:木兰脂素中剂量组;MOH组:木兰脂素高剂量组

表4 各组鼻黏膜成纤维细胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10蛋白表达水平比较

4 讨论

遗传和环境因素均可参与AR的发病,目前已发现有多个基因及转录因子参与本病的发生[12],表观遗传学研究发现,环境的改变可通过遗传学机制致病,导致呼吸道黏膜免疫系统先天性及获得性免疫紊乱[13],诱导成纤维细胞等分泌免疫活性因子,增加个体对AR的易感性。目前,临床上常用的AR治疗药物虽有一定效果,但可能由于作用靶点单一、对局部免疫调控作用并不理想等原因,其临床效果常难以令人满意[14]。而挖掘新的、高效的AR治疗药物仍是目前该领域研究的重点。

基础致敏和局部攻击致敏是目前常用的AR建模方法,可诱导机体鼻黏膜产生特异性免疫球蛋白E抗体,增加机体AR的易感性,本研究采用该方法对豚鼠建立AR模型,建模成功率高达96.00%,与既往报道一致[15]。AR患者常见临床表现有鼻痒、流涕、喷嚏等,控制上述临床表现应当作为此类患者治疗的首要任务。本研究中,氯雷他定和木兰脂素各剂量干预后抓鼻、流涕、喷嚏症状评分及总分均下降,且低于模型组,可知氯雷他定与木兰脂素可有效减轻AR相关症状,且高剂量木兰脂素效果最佳。氯雷他定属于第二代抗组胺药物,也是目前临床上一线抗敏药,高效持久,可快速阻断体内过敏反应,但仍有部分AR患者采用氯雷他定治疗后效果不佳。木兰脂素是由辛夷提取并精制而成的药物,具有消炎、止痒、抗敏作用。根据中医学理论,AR属于“鼻鼽”范畴,与肺脾气虚关系密切。肺气虚弱,卫表不固,则腠理疏松,风寒乘虚而入,上及鼻窍,正邪相搏,肺气不得通调,津液不通,聚于鼻窍,拥塞气阻,可致喷嚏流涕;脾气虚弱,生化无源,累及肺脏,肺气甚虚,则鼻窍不通,外邪从口鼻侵入,停聚鼻窍。因此鼻鼽治疗应以健脾养肺、通窍利窍为原则。辛夷性温、味辛、芳香,归肺经、胃经,可散风寒、通鼻窍,既可祛除体内、体表之寒气,又可发散风邪、通利鼻窍,善治外感风寒、肺窍郁闭之症。现代中医学家认为辛夷可利九窍[16],也有药理研究证实木兰脂素可显著抑制致敏豚鼠离体回肠收缩,还可组织肥大细胞脱颗粒,增加毛细血管的通透性[17-19],认为该药物属于一种天然的高效抗敏剂。本研究还发现,氯雷他定组和木兰脂素各剂量组鼻黏膜组织病理改变均减轻,且木兰脂素高剂量组与空白组最为接近,表明木兰脂素可减轻AR豚鼠的鼻黏膜组织病理改变,也证实该药物具有良好的抗过敏作用。

特异性个体再次接触变应原后可产生免疫反应,导致炎症性病理改变,包括速发相反应和迟发相反应,前者多发生于变应原接触5～10min后,约持续0.5～2 h,后者发生于变应原接触4～8 h后,约持续24～48 h。在免疫反应过程中,T淋巴细胞、肥大细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等均有参与,可促使递质释放和细胞因子产生,其中成纤维细胞可参与速发相反应和迟发相反应,是免疫反应过程中不可或缺的因素[20]。Fyn-STAT5通路是免疫球蛋白E介导的与肥大细胞活化相关的变态反应的重要途径,其中Fyn属于细胞内非受体型酪氨酸激酶,可正向调节肥大细胞脱颗粒;STAT5属于STAT家族的重要组成部分,在肥大细胞发展和生存过程中有关键性作用,还可介导肥大细胞激活变态反应[21-22]。SCF和IL-10均为Fyn-STAT5通路的重要调控因子,且在变应性疾病发生和发展过程中均有重要作用,其中SCF可调节造血细胞和免疫细胞生成,IL-10则可调节炎性反应,发挥负向免疫调节作用;还可减少T细胞应答,增强B细胞功能[23-24]。有报道指出[25],AR建模成功后,鼻黏膜成纤维细胞中Fyn、SCF基因与蛋白表达水平均较正常健康豚鼠升高,而STAT5、IL-10基因与蛋白表达水平均下降,因此在AR治疗时可尝试调控Fyn-STAT5通路,抑制Fyn、SCF基因与蛋白表达、上调STAT5、IL-10基因与蛋白表达发挥治疗免疫调控作用。本研究中,模型组Fyn、SCFmRNA及蛋白表达水平均较空白组升高,而氯雷他定组和木兰脂素组Fyn、SCFmRNA及蛋白表达水平均较模型组下降,且STAT5、IL-10mRNA与蛋白表达变化趋势则正相反,本研究报道和上述报道相符,表明氯雷他定和木兰脂素均可调控AR豚鼠鼻黏膜成纤维细胞Fyn-STAT5通路,抑制Fyn、SCF表达,上调STAT5、IL-10表达,且木兰脂素的作用呈剂量依赖性。

综上所述,木兰脂素可减轻AR豚鼠鼻部症状和鼻黏膜组织病理改变,推测是通过调控鼻黏膜成纤维细胞Fyn-STAT5通路,调节鼻黏膜组织的免疫活性实现的。但木兰脂素治疗AR患者的可行性及安全性仍需进一步探讨。