Box-Behnken响应面法优选消银颗粒总黄酮工艺

康亚男 张文霞

【摘 要】

目的：响应面法优选消银颗粒总黄酮提取工艺。方法：以总黄酮得率为指标，以乙醇浓度、提取时间、液料比为考察因素，在单因素實验的基础上，采用响应面法优选出消银颗粒总黄酮提取工艺。结果：最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60%、提取时间33 min、液料比16∶1，此条件下总黄酮得率为3.24%。结论：优选得到的消银颗粒总黄酮的提取工艺准确可行，质量稳定。

【关键词】 消银颗粒；响应面；总黄酮；提取工艺

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）06-0039-03

Optimization of Total Flavonoids in Xiaoyin Granules by Box Behnken Response Surface Methodology

KANG Yanan ZHANG Wenxia*

Dezhou Lingcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Dezhou 253599，China

Abstract：

Objective to optimize the process of total flavonoids in Xiaoyin granules by response surface methodology. Methods taking the yield of total flavonoids as the evaluation index， ethanol concentration， extraction time and liquid-solid ratio as the investigation factors， the best extraction process of total flavonoids from Xiaoyin granules was optimized by box Behnken response surface method on the basis of single factor experiment. Results the optimum extraction conditions of total flavonoids from Xiaoyin granules were as follows： ethanol concentration 60%， extraction time 33 min and liquid-solid ratio 16∶1. Under these conditions， the yield of total flavonoids was 3.24%. Conclusion the optimized extraction process of Flavonoids from Xiaoyin granules is accurate and feasible， and the quality is stable.

Keywords：

Xiaoyin Granules; Response Surface; Total Flavonoids; Extraction Process

消银颗粒是由地黄、牡丹皮、赤芍、牛蒡子、蝉蜕、白鲜皮等13味中药经加工制成的复方颗粒制剂，被列为《国家级新药》中药品种，具有清热凉血、祛风止痒之功效，临床上常用于治疗银屑病、荨麻疹［1-2］。研究［3-11］显示，消银颗粒组方中的地黄、牡丹皮、赤芍、苦参、金银花、玄参等9味组成药中均含有黄酮类成分，具有抗氧化型、清除自由基、延缓衰老、改善血液循环、降低胆固醇、改善睡眠等多种药理活性，是消银颗粒发挥清热解毒、凉血祛风、补血润肤作用的主要药效成分。目前，对于消银颗粒的质量控制主要以芍药苷、苦参碱、绿原酸等非黄酮类成分进行测定［12］，对黄酮类成分提取工艺研究还未见相关报道。Box-Behnken响应面法是采用二次回归方程，拟合多个因素与多个响应值之间关系进行建模和分析，再通过回归方程分析优选出最佳提取工艺参数的方法［13］，已被广泛用于中药及其制剂的有效成分工艺优化研究。

因此，本试验在单因素的基础上，采用响应面法优化消银颗粒总黄酮提取工艺，为消银颗粒的质量标准提升和有效成分提取提供依据。

1 仪器与试药

CPA225D型电子天平（德国赛多利斯）；UV5500紫外光度计（上海元析仪器有限公司）。消银颗粒购自康盛大药房（批号20201126）。芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所（批号100080-201605）；乙醇为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 对照溶液的制备 精密称取干燥的芦丁对照品10.0 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，冷却后，加甲醇至刻度，摇匀，得0.1 mg/L的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取消银颗粒1.0 g，置于25 mL锥形瓶中，加入60%乙醇浓度16 mL，超声提取33 min，得供试品溶液。精密量取2 mL于25 mL容量瓶中，按“2. 1. 2”项方法测定并计算总黄酮得率。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分别置于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加10% Al （NO3）3溶液1 mL 摇匀，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，于500 nm 波长下测定，用相应的试剂作空白。以吸光度Y做横坐标，浓度X做纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y=17.92X-0.006（r=0.9992），表明在质量浓度0.004～0.02 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.1”项下对照品溶液1.0 mL，放在10 mL容量瓶中，加甲醇适量，定容摇匀，吸取适量在500 nm 波长下平行测定 6次，对测定的吸光度值进行分析。结果芦丁吸光度RSD为1.05%，表明仪器的精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取消银颗粒，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，吸取适量在500 nm 波长下平行测定，将吸光度值代入回归曲线方程，计算总黄酮含量。结果总黄酮平均含量为30.16 mg/g，RSD为1.25%，表明重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 对所制备的供试样品溶液分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h于500 nm波长下测定吸光度值，将吸光度值代入回归曲线方程，计算总黄酮含量。结果总黄酮含量的RSD为0.95%，表明供试品溶液避光条件下12 h内基本稳定。

2.1.7 加样回收率试验 取消银颗粒0.5 g，平行6份，按照1∶1的比例加入芦丁对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品，吸取适量在500 nm 波长下平行测定，将吸光度值代入回归曲线方程计算总黄酮含量及回收率。结果见表1。

2. 2 响应面法优化总黄酮提取工艺

2.2.1 单因素考察 以总黄酮得率为指标，分别对乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%）、提取时间（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min）、液料比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1）进行考察。结果显示，乙醇浓度选择60%、提取时间选择30 min，液料比选择15∶1为最佳提取条件。

2.2.2 响应面设计 在单因素试验的基础上，选择乙醇浓度、提取时间、液料比为考察因素，利用Box-Behnken软件设计总黄酮提取条件。各因素水平设计见表2。消银颗粒Box-Behnken中心组合试验设计和结果见表3。

2.2.3 方差分析 消银颗粒总黄酮含量对乙醇浓度、提取时间、液料比的回归方程为：Y=3.21+0.030A+0.13B+0.076C-0.045AB+0.002AC-0.017BC-0.43A2-0.42B2-0.24C2Z。式中Y代表消银颗粒总黄酮含量。方程回归分析及方差分析结果见表4。结果显示，在设定的区域内，所建立的模型达到极显著水平（P<0.0001），其中二次项中A2、B2和C2的P值均达到了极显著水平（P<0.01），表明方程拟合较好。

2.2.4 响应面分析 应用 Design-Expert 9.0.4 软件绘制出所考察指标与影响较显著的3個自变量的等高线图，具体如图1。结果最佳提取工艺为：乙醇浓度60.3%、提取时间32.3 min、液料比15.8∶1，预测总黄酮得率为3.22%。

2.2.5 试验验证 根据优选出的结果平行 3 份试验提取消银颗粒总黄酮。考虑到实际操作的方便可行性，将条件修正为：乙醇浓度60%、提取时间33 min、液料比16∶1，此条件下总黄酮得率为3.24%，与理论预测值无显著性差异，方程与实际情况拟合良好。

3 讨论

3.1 提取方法的选择 消银颗粒组成药中包括地黄、牡丹皮、金银花、白鲜皮、大青叶、红花在内的多种中药均含有黄酮类成分，超声和回流提取2种方法提取结果显示，超声提取较回流提取效果更佳，且具有操作简单方便，提取时间短、提取温度低、提取杂质少、提取成本低等优势，因此，选择超声提取法提取消银颗粒中总黄酮。

3.2 优化方法的选择 正交设计是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，具备“均匀分散，整齐可比”的特点，但也存在着重点不突出、适用试验水平数不高的试验等缺点。响应面法是一种将统计学和数学技术融为一体，采用回归方程来拟合各因素水平与响应值之间的函数关系，解决多变量问题的一种统计方法，具有只要模型建立正确，就可预测任一条件组合下的响应值直观地看出函数关系的优点，已被广泛用于药用植物多糖、黄酮、多酚等活性成分的提取工艺优化。因此，本项目选择响应面法优选消银颗粒总黄酮提取工艺。

4 小结

消银颗粒处方中多种组成药含有黄酮类化合物，可能是消银颗粒发挥药效的主要化合物。本实验所得消银颗粒总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度60.3%、提取时间32.3 min、液料比15.8∶1。此条件下总黄酮提取率最高，为3.22%，验证实验结果也表明响应面法优选的提取工艺是最优工艺，为消银颗粒质量标准的提升完善提供了依据。

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（收稿日期：2022-08-01 编辑：刘 斌）