水产品中丁香酚类化合物检测

◎陈晓青

（普识（厦门）检测认证有限公司，福建 厦门 361100）

1 丁香酚类化合物概述

丁香酚（G0H12O2）是一种植物化学物质，存在于丁香、肉豆蔻油、肉桂、罗勒和月桂叶中。有研究表明，低浓度条件下，丁香酚类化合物具有抗菌和抗氧化双重活性，但在高浓度条件下，却表现出毒副作用[1]。如高浓度丁香酚显示出对小鼠具有致癌和致突变作用。此外，部分研究显示丁香酚类化合物具有肝毒性、促炎症、皮肤刺激性等危害，但其发挥功能活性和产生健康危害间的剂量界限仍较为模糊[2]。因此，人们对丁香酚类化合物的功能活性、毒副作用的研究越来越多，其检测方法也趋于多样化。世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）已确定可接受的人均丁香酚日摄入量为2.5 mg·kg-1（JECPA 2006）。日本规定水产品可采用丁香酚类化合物作为麻醉剂，最大残留限量为50.0 μg·kg-1。然而，目前我国尚未出台政策规定其添加限制和检测方法。因此，建立丁香酚类化合物的标准检测方法具有重要的意义。本文基于2019年我国市场监管总局发布的《水产品及水中丁香酚类化合物的测定》（BJS 201908）公告，在查阅相关文献的基础上，对目前丁香酚类化合物的检测方法进行综合阐述，以期为丁香酚类化合物的检测及风险控制提供理论指导。

2 丁香酚类化合物检测方法

2.1 气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）

该方法为《水产品及水中丁香酚类化合物的测定》（BJS 201908）中规定的检测方法，首先配制标准工作液：以1 mg·mL-1的丁香酚类物质标准液作为母液，吸取该母液100 mL，乙腈定容至10 mL，得到浓度为10 μg·mL-1的标准物质中间液，利用中间液依次稀释至1 000 ng·mL-1、500 ng·mL-1、200 ng·mL-1、100 ng·mL-1和40 ng·mL-1，即为标准工作液。水产品在检测前，需进行粉碎、乙腈提取、DMSO辅助氮吹的方法使样品中的丁香酚类化合物得到浓缩，其中氮吹所用温度为40 ℃。所得浓缩样品过0.45 μm滤器待测。气相色谱柱为DB-1701（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），升温程序为初始温度100 ℃保持1 min，之后6 ℃/min 升温至200 ℃,然后25 ℃·min-1升温至260 ℃，保持5 min；进样口温度设为230 ℃，以氦气为载气。质谱中电离方式为电子轰击电离源，离子源温度230 ℃。GC-MS/MS可用于水及水产品，如淡水虾、淡水鱼、海水虾、海水鱼中的丁香酚类化合物（丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、顺式-甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚）的检测。该方法在水取样量2 g或水产品取样量5 g，均定容至1 mL时，各丁香酚类化合物的检出限为0.01 mg·kg-1，定量限为0.02 mg·kg-1[3]。本法限制性在于气相色谱法气化时的高温会影响丁香酚类化合物的稳定性。

2.2 液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）

为克服GC-MS/MS中进样口高温对检测样品的影响，学者们尝试通过不需高温的HPLC-MS/MS进行丁香酚类化合物的检测。标准工作液准备步骤与GCMS/MS相同，但所得最终浓度为500 ng·mL-1、200 ng·mL-1、100 ng·mL-1、50 ng·mL-1和20 ng·mL-1。样品中丁香酚类物质提取除GC-MS/MS中所述步骤外，该方法利用了OasisμPRiME HLB固相萃取柱对样品进行净化处理。在对样品的浓缩过程中，与GC-MS/MS所述方法不同，该法经尝试不同浓缩条件后确定不加DMSO，在35 ℃条件下进行氮吹，此条件下加标样品回收率较高。液相色谱柱采用Phenomenex Kinetex C18 柱（100 mm×3.0 mm，2.6 mm），以水（流动相A）和甲醇（流动相B）作为流动相进行梯度洗脱：0~1 min时，50%B；1~5 min时，50%~70%B；5~6 min时，70%B；6~8 min时，70%~95%B；8~11 min时，95%B；10~13 min时，50%B。流动相流速为0.3 mL/min，柱温控制在40 ℃，进样体积1μL。在该液相条件下，6种丁香酚类物质可得到有效分离。质谱条件采用电喷雾离子源，离子源温度设为550 ℃，雾化器流量60 L·min-1。采用以上方法对养殖水、虾和鲫鱼中的丁香酚类化合物进行了不同水平的加标回收试验。结果显示，丁香酚类化合物加标回收率均在72.6%~109.2%，相对标准偏差小于15%，检出限与定量限与GC-MS/MS相同，其准确度及精密度均可满足相关分析测试要求[4]。

2.3 固相微萃取-高效液相色谱检测法

由于水产品中丁香酚类化合物含量低且干扰物复杂，直接对样品进行检测较难实现。为避免水产品中基质干扰，有必要在检测前对目标化合物进行纯化分离和富集。学者们尝试通过不同方法对样品中的丁香酚类化合物进行萃取、浓缩后再进行检测。因萃取过程即对丁香酚类化合物进行了分类纯化，故后续检测只需采用HPLC即可进行，不再需要质谱检测。有学者通过合成氟化共价有机聚合物（F-COP），再通过黏合法将F-COP涂层均匀的分布于石英棒表面，得到F-COP-SPME石英棒。在样品经过GC-MS/MS中的处理过程后，将3 mL溶液置于4 mL样品瓶中，插入F-COP-SPME石英棒，室温下萃取30 min后，采用乙腈联合超声方法对石英棒中的丁香酚类化合物进行解吸，所得解吸液过0.45μm滤器后采用HPLC-UV于280 nm处进行定量分析。该方法不需质谱检测，对实验设备要求低，但只能进行丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚3种物质的检测[5]。

2.4 化学发光酶免疫分析法（CLEIA）

无论是GC-MS/MS或HPLC-MS/MS，仪器检测分析方法均需要昂贵设备及专业人员，且检测效率较低。开发便捷、高通量的检测方法，则更适用于大批量样品的筛查和风险评估。免疫分析法因其灵敏度高、操作简便及可进行高通量筛选等优点被用于多种化合物的检测分析。学者将合成的丁香酚半抗原Eul-4-Tbl通过活泼酯法与BSA相联为Eul-4-Tbl-BSA作为免疫抗原，与OVA相联为Eul-4-Tbl-OVA形成包被抗原。采用免疫抗原Eul-4-Tbl-BSA对新西兰白兔进行免疫，经多次免疫后得到兔源多抗血清，硫酸铵沉淀得到Eul多克隆抗体。检测时，只需将待测物和Eul多克隆抗体加入被包被抗原Eul-4-Tbl-OVA包被过的96孔板中于37 ℃反应，再加入化学发光液ECL检测发光强度即可对样品中丁香酚类化合物进行定量检测。该法加标回收率76.6%~108%，检出限为0.11μg·L-1，可用于水产品中丁香酚类化合物的检测且受其他物质的干扰较小[6]。

2.5 超声辅助深共晶液-液微萃取分析法（UA-DESLLME）

UA-DES-LLME分析法所需时间短、效率高且绿色环保。近年来，在多种化合物检测中得到了迅速发展。有学者通过优化相关条件，将此方法用于丁香酚类化合物的检测中。以百里酚作为氢键受体（HBA），以乙酰丙酸为氢键供体（HBD），将HBA与HBD以1∶2的比例混匀后加热1 h即得到萃取效率较高的深共晶溶液（DES）。将400 μL DES与样品混合后，pH=3条件下，超声3 min，5 000 rpm离心10 min，取上清100 μL加入一定体积的甲醇中，0.45μm滤器过滤后通过气相色谱检测样品中丁香酚、异丁香酚和甲基异丁香醇含量。经过与其他检测方法，如GC-MS/MS、HPLC-MS/MS比较，UA-DES-LLME具有相似的回收率、线性范围和RSD，可应用于实际样品的检测，被证明是分析水产品中丁香酚、异丁香酚和甲基异丁香醇更经济绿色的方法[7]。

3 结语

目前，我国尚未对丁香类化合物在水产品中的限量值做政策规定。文献显示，我国农贸市场中丁香酚类化合物检出率已超10%，鉴于目前丁香酚类化合物对人体健康的危害，亟需对该类物质使用时添加量限定值及检测方法出台相应政策规定。