食品微生物检测的质量控制

◎孟凡荣，季加才

（山东润达检测技术有限公司，山东 潍坊 261000）

食品微生物检验可以有效地减少食物中毒的发生，对提高食品质量方面有重大意义。微生物检验质量控制包括内部质量控制和外部质量控制。内部质量控制是在实验室内部实施的，是质量控制的主要手段；外部质量控制是由实验室外部的组织或机构对实验室进行的质量评价。

1 内部质量控制

1.1 人员

检测中，微生物检测人员无菌观念必须强而牢固，整个流程均应做到无菌操作[1]。动作要迅速，从分离、纯化到接种，操作必须符合规范要求，防止样品受到二次污染。因微生物繁殖速度较快，所以对于检测微生物项目的样品，业务室流转到实验室后必须尽快检测，检测微生物参数的样品必须在当天完成检测前处理。

1.2 仪器设备

微生物实验室常用设备包括超净工作台、生物安全柜、电热鼓风干燥箱、生化培养箱、霉菌培养箱、高压灭菌锅等。实验室应建立仪器档案，做到一机一档，实行仪器身份管理[2]。使用前检查运行状态，日常严格执行仪器设备使用登记，对需要检定校准的仪器设备必须进行检定校准，确保仪器设备均处在最佳工作状态。

1.2.1 超净工作台

水平流净化工作台工作区域内洁净度级别为100级，空气沉降暴露时间为30 min,所生长的菌落数＜1.00 CFU/皿；垂直流净化工作台，所生长的细菌数应＜0.49 CFU/皿。超净工作台需要进行悬浮粒子与沉降菌检测。使用的高效过滤膜每年都需要更换。

1.2.2 生物安全柜

生物安全柜是防止在实验操作过程中的生物微粒发生气溶胶散逸的柜式空气净化负压安全装置,生物安全柜分为I级生物安全柜、II级生物安全柜和III级生物安全柜3类柜型，II级生物安全柜是目前实验室内应用最普遍的柜型，实验室参照《生物安全实验室建筑技术规范》(GB 50346—2011)和《II级生物安全柜》(YY 0569—2011)定期对生物安全柜噪声[3]、照度、洁净度尘埃粒子数、下降气流平均流速、流入气体平均流速等主要性能进行检查。定期由专门技术人员更换滤网。

1.2.3 电热鼓风干燥箱

电热鼓风干燥箱用于玻璃器皿、不锈钢器皿等灭菌，温度与精确度要求为160 ℃±5 ℃或180 ℃±5 ℃，灭菌时间前者为2 h，后者为1 h。电热鼓风干燥箱校准时间一般为1年1次，期间根据使用频次做好核查。

1.2.4 生化培养箱

生化培养箱用于微生物的培养，不同微生物培养温度要求不同，应根据标准要求设置。生化培养箱校准时间一般为1年1次，使用的不同温度均应校准，期间根据使用频次做好核查。日常工作中，注意生化培养箱日常卫生维护，应在每日工作温度稳定时做好相应的温度监控。

1.2.5 高压灭菌锅

为了保证灭菌效果，实验室一般采用化学变色指示卡、生物指示菌等方法对高压灭菌效果进行监控。大容量的高压灭菌锅属于特种设备，需由专人持特种设备上岗证进行上岗操作，并填写好每次的使用记录。在使用时检测人员应及时填写高压灭菌锅的日常使用记录，一般包含开关机时间、灭菌温度及压力、灭菌时长、需灭菌的物品和高压灭菌胶带的颜色变化。特殊培养基需按其说明书要求进行灭菌，高压灭菌锅校准周期一般为1年。

1.2.6 其他微生物检测仪器

冰箱、水浴箱等应在每日工作温度稳定时做好相应的温度记录或温度监控,厌氧培养罐或厌氧培养应以美兰为指示剂进行监控。

1.3 培养基和试剂

培养基作为微生物检测常用的试剂，培养基的质量直接关系到实验的成败，对检测结果有重大影响。影响培养基质量的因素很多，主要包括基础成分的质量、制备过程的控制和储存条件等。

1.3.1 培养基验收

培养基到货时，试剂管理员进行验收，在培养基验收单上填写培养基品名、编号、型号、批号以及生产厂家。对包装的标签、密封状态、包装物状态如实填写。实验室设置的试剂验收员应按《食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》(GB 4789.28—2013)对培养基进行质量验收。

1.3.2 培养基的实验室制备

使用商品化脱水合成培养基时，要严格按照产品的使用说明书及《食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》(GB 4789.28—2013)的要求进行制备，配制培养基时，要及时做好相关记录培养基名称、配制日期、称取质量、配制体积、pH值、灭菌方式、灭菌条件、配制人、生产批号、厂家、添加剂使用等信息，以便溯源。

1.3.3 培养基平板的制备和储存

倾注好的琼脂平板尽量立即使用，如果需储存，则需将凝固后的平板密封、避光存放于冷藏冰箱中，并在平板上标记好培养基名称、制备日期和有效期。

1.3.4 培养基使用注意事项

经过高压灭菌后的培养基应尽量缩短再加热的时间，避免过度加热。融化后的培养基保温时间不易过长。剩余的培养基不能重新凝固留待下次使用。

1.4 器皿和材料

用于微生物学检测的玻璃器皿保证其处于洁净和无菌状态直接使用。所有与培养物接触的器具都应进行无菌化处理（灭菌），检测用品要放置在专用包装纸、铝箔纸等包裹，试管和瓶子要采用适当方式塞住，如使用橡胶塞塞住，以达到灭菌效果。灭菌后的材料应与未灭菌的标示区分。

1.5 标准或质控菌株管理

1.5.1 菌种的购买和验收

标准菌种应从专业的菌种保藏机构购买，并且要其能提供潮源性证明。购买的菌种应进行验收，主要检查外包装、数量及菌种外观。要求外观无破损、标识正确清楚、数量正确、有标准菌种编号和溯源性证明资料。验收菌种还包括技术性鉴定菌种，检查菌种与资料是否相符、菌种活力是否足够等[4]。

1.5.2 标准或质控菌株活化

（1）菌种概念。原代是指自权威菌种保藏中心购买回的原始冻干菌种或标准菌株。从其中(未经培养)转接出来并经过培养而得的菌种为第一代；从第一代转接出来并经过培养而得的菌种为第二代；每经过一次转接和培养即为一代，依此类推。标准菌种用适合的培养基制备菌悬液，放置在不高于-70 ℃低温冷冻保存。工作菌种是指从保存菌种经过转接培养后，仅用于工作使用的标准菌株，根据国家标准《实验室质量控制规范 食品微生物检测》（GB/T 27405—2008）规定配制与保存。

（2）菌种活化。菌株活化后，需要对菌种进行验证，保证纯度，可通过分离培养基划线等方式观察菌落形态，通过革兰氏染色等形式于显微镜下观察，并用生化试验等方式进行生化鉴定。菌株活化注意培养温度和氧气条件。

1.5.3 菌种保存

将购回的原代菌种按其说明书或有关资料说明接种斜面试管若干支，并于相应的(见菌种说明书)温度培养，培养后2～8 ℃或-80 ℃保存。低温(2~8 ℃)条件下，除霉菌保质期为3个月外，其余菌种保质期均为1个月。每次传代时挑取一环菌种，划线接种到普通营养琼脂平板，进行菌种鉴定。保存的菌种应有相应的标识，包括菌种名称首字母缩写、菌种编号、传代时间及代数等信息。

1.5.4 菌种的使用

当需要使用工作菌种时，从斜面保存菌种中挑取一支传代，培养后作为工作菌种使用，使用人须核对以下信息，包括但不限于菌株的名称、传代的次数、传代的日期、菌株的编号等信息，应注意观察菌种形态，确定是否污染杂菌、退化、死亡，保证菌种的使用性能。工作菌种使用不能超过5代。

1.5.5 菌种的销毁

菌种及工作中产生的菌液使用后应对其进行销毁，不作重复保存和使用。废弃菌种、菌液一般在121 ℃、30 min条件下进行高压灭菌销毁。

1.6 检测方法

检测方法的现行有效版本也是食品检测微生物实验室质量控制的一部分，目前国内外食品微生物检测方法包括国家标准 4789系列、进出口检验检疫行业标准、国际化组织、国外的健康部门（加拿大健康保护部）、行政执法部门（美国食品药品监督局）以及一些协会（美国官方分析化学师协会）等颁布的标准。国内确认标准有效性的标准查询网址主要包括全国标准信息公共服务平台和国家标准全文公开系统、全国农业食品标准公共服务平台、国家卫生健康委食品安全标准与监测评估司等平台,检测实验室应按照自己的体系文件定期对标准进行查新，保证检测方法文本的现行有效性。

1.7 检测过程质量控制

（1）定期使用阳性菌株或质控样品进行内部质量控制。

（2）食品微生物检测内部质量控制的方式主要包括阳性样品的留样再测、方法比对、人员比对、设备比对等。

（3）对于定性检测参数可用实验室内标准菌株进行加标试验，定量检测参数可用有相关证书的质控样品进行质控。

2 外部质控

外部质控方式主要包括参加能力验证、实验室间的比对[5]、测量审核和盲样考核等。在参加比对试验或能力验证中出现检测结果离群时，必须采取纠正措施，分析原因，开展有效的整改活动。

在进行外部质控控制时，需用同类样品进行模拟实验，进一步熟悉和确认实验方法，掌握关键步骤，模拟实验一般不少于2次。当能力验证结果为满意时，说明本实验室检测分析数据可靠有效，检测方法切实有效，技术部需继续保持并不断提高检验技术水平。

3 结语

综上所述，影响食品微生物检测质量控制的影响因素很多，在平时的检测过程中，我们可以从人、机、料、法、环、测等几个方面入手，提高食品检验实验室的质量控制和管理水平,不断提升食品安全检验检测综合实力[6]，为食品安全保驾护航。