以AFP升高为主要表现的成人Wilson病的临床和遗传学特征

李旋 黄燕 赵卫峰 杨永峰 甘建和

肝豆状核变性 (hepatolenticular degeneration,HLD)又名 Wilson病 (WD),是一种常染色体隐性遗传的单基因、可治性疾病,致病基因 ATP7B定位于染色体 13q14,3,编码一种铜转运P型ATP酶[1,2]。ATP7B基因缺陷导致铜代谢障碍,铜在身体多处沉积,以肝脏和大脑最明显。流行病学资料显示WD在世界范围发病率为1/3万～1/10万,我国发病率高达6/10万,其致病基因携带率约为1/90[3,4]。WD好发于青少年,男比女稍多。现报道1例无明显临床症状、仅出现以AFP升高为主要表现的成人肝豆状核变性的临床特点,分析ATP7B基因突变的遗传学,为该病的诊断和治疗提供参考。

资料与方法

一、研究对象

中年女性,49岁,因AFP升高2月余,仅上腹部轻微不适就诊。无黄疸及其他特殊不适。2018年6月10日查AFP 95.82 ng/mL,ALT 73.51 U/L, AST 63.07 U/L, GGT 200.43 U/L。胃镜示胆汁反流性胃炎。保肝降酶、随访观察。2018年8月3日查AFP 97.47 ng/mL。肝炎病毒全套阴性。抗核抗体+自身免疫肝病抗体全套阴性。腹部MRI平扫: 肝硬化伴多发再生结节。MRCP:未见明显异常。2018年8月14日查血常规: WBC 4.79×109/L, Hb 130 g/L, PLT 151×109/L。生化: TBil 19.28 μmol/L, ALT 105.9 U/L, AST 77.7 U/L, GGT 334.6 U/L, Alb 39.5 g/L, Glb 25 g/L,AFP 124.5 ng/mL。以肝硬化、肝细胞癌?收治入院。既往胆囊结石手术史10余年,否认病毒性肝炎、糖尿病、肾脏病、高血压病史、饮酒史、长期药物使用史、遗传病史、有毒有害物质接触史。体格检查:血压 112/60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),BMI=20.81 kg/m2。TBil 23.9 μmol/L, ALT 103.6 U/L, AST 79.5 U/L, GGT 358.7 U/L, Alb 40.7 g/L, Glb 27.8 g/L, 血脂正常。AFP 163 ng/mL。凝血功能: PT 14.1 s, Fbg 1.76 g/L, INR 1.11。抗核抗体+自身免疫肝病抗体全套:阴性。CMV DNA+EBV DNA 阴性。2018年8月16日普美显MRI+MRCP:肝硬化伴多发再生结节形成,MRCP未见明显异常。患者出现AFP进行性升高,但无明显肿瘤消耗症状,同时影像学检查未见肿瘤表现。为进一步明确诊断于2018年8月21日肝组织穿刺病理活检示:肝硬化伴肝细胞重度脂肪变性。结合临床及病理高度怀疑肝豆状核变性,随后完善相关特异性检查,铜蓝蛋白 0.07 g/L(正常<200 mg/L);眼角膜K-F环:阴性;血清铜 381.6 μg/L(正常700～1400 μg/L);24 h尿铜含量 176.5 μg/24 h(正常15～60 μg/24 h);头颅CT未见明显异常。

二、研究方法

(一)临床资料 收集患者临床资料,包括一般资料、临床表现、生化指标、影像学资料,肝组织病理资料,基因检测结果等。

(二)外显子捕获测序 基因检测有助于WD的早期诊断及治疗。在获得患者知情同意后,通过二代测序(NGS)技术筛查致病基因,以明确诊断。用EDTA抗凝管采集患者外周血2 mL。按照QIAamp DNA提取试剂盒说明书抽提患者基因组DNA,并建立含有与肝豆状核变性相关基因的全基因组文库,利用MiSeq测序仪(illumina Inc,USA)进行高通量测序。利用生物信息学软件工具对测序数据进行基因序列分析,找出致病基因并且预测变异的致病性。

(三)突变前后的蛋白空间结构对比分析 用SWISS-MODEL构建ATP7B野生型和突变型蛋白序列所对应的蛋白三级结构模型,并比对模型间的构象差异,判断基因突变对蛋白质结构和功能的影响。

结 果

一、MRI普美显+MRCP结果

肝脏表面凹凸不平,肝左叶增大,T2WI肝脏内多发低信号结节,增强未见异常强化,普美显延迟期未见明显低信号。门脉主干及分支显影正常,肝内外胆管未见扩张。腹膜后和肠系膜区未见肿大淋巴结。脾脏体积增大。肝硬化伴多发再生结节。见图1。

图1 MRI普美显+MRCP影像学表现

二、肝活组织病理检查结果

肝小叶结构中度紊乱,肝细胞轻中度浊肿伴点灶性坏死,肝细胞大泡性脂肪变性,肝细胞糖原性空泡核形成,玫瑰花结形成,汇管区轻中度扩大,炎性细胞浸润,纤维组织增生,中度慢性肝炎G2-3,S1-2 伴部分自身免疫性肝炎。见图2。

注:A为HE染色,4X; B为HE染色,4X; C为HE染色,10X

三、遗传学分析结果

外显子组捕获测序在患者ATP7B基因检测到两个突变,分别是Exon15 c.3316G>A p.(Val1106Ile)和 Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)。见表1。

表1 基因分析结果

四、蛋白结构预测分析

通过对比正常碱基序列,并进一步采用SWISS-MODEL同源建模,构建预测蛋白质模型。见图3、图4。

注:p.(Arg778Leu)突变前后ATP7B蛋白结构飘带图,A为野生型ATP7B蛋白(Arg);B为突变型ATP7B蛋白(Leu)。p.(Val1106Ile)突变前后ATP7B蛋白结构飘带图;C为野生型ATP7B蛋白(Val);D为突变型ATP7B蛋白(Ile)

注:p.(Arg778Leu)突变前后 ATP7B蛋白空间结构预测图,A为野生型 ATP7B蛋白结构模型;B为突变型ATP7B蛋白结构模型,第778位氨基酸由精氨酸(图A)变为亮氨酸(图B);C显示突变后可能会影响a螺旋结构的稳定性,进而可能影响蛋白结构或者功能。p.(Val1106Ile)突变前后 ATP7B蛋白空间结构预测图;D为野生型 ATP7B蛋白结构模型;E为突变型ATP7B蛋白结构模型,第1106位氨基酸残基由缬氨酸(图D)变为异亮氨酸(图E);F显示突变后的氨基酸与周围氨基酸存在相互排斥,可能由此影响蛋白功能

五、治疗及转归

基因检测结果显示存在ATP7B基因突变。根据WD的Leipzig评分系统为7分,最终诊断为Wilson病。给予青霉胺+葡萄糖酸锌联合治疗后,效果确切,患者ALT、AST、AFP水平明显下降,见图5和图6,并逐渐恢复至正常,肝纤维化程度亦下降,见图7,患者肝功能得到好转,病情稳定后出院。

图5 患者治疗前后ALT、AST变化

图6 患者治疗前后AFP变化

注:患者治疗后经Fibroscan检测,肝脏硬度值明显下降,脂肪衰减值亦明显下降

讨 论

WD致病基因 ATP7B定位于染色体 13q14,3,编码的铜转运P型ATP酶参与铜的跨膜转运,将铜离子转运给铜蓝蛋白前体以合成全铜蓝蛋白,使铜离子能够从肝细胞转运至胆汁, 经胆道排出体外[5-7]。如果该酶功能缺陷,血清铜蓝蛋白合成减少,铜离子经胆汁排出障碍,多余的铜沉积于肝脏, 并分泌入血,沉积在脑、肾、骨、角膜等器官组织,从而导致肝脏损伤、神经和精神系统异常、肾脏损伤、骨关节病,以及角膜K-F环等多种临床表现。以肝脏或神经系统的损伤为主。肝病表现通常早于神经系统,临床上可表现为无症状、急性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化等多种形式[5]。肝脏损伤后,动员肝前体细胞增殖分化,此过程引起AFP的分泌。正常人血清中AFP<20 μg/L。肝细胞癌,活动性肝炎等都会导致AFP升高。AFP在肝脏慢性炎症中的增高反映肝细胞炎症、坏死和再生。在肝损伤患者中,AFP的数值常呈一过性升高,经保肝等治疗后,AFP常能恢复正常。若AFP增高幅度过大,数值过高,应高度警惕原发性肝癌[8]。本例患者AFP虽较正常明显升高,但无肿瘤消耗性表现,影像学不支持,病理未见肿瘤细胞,最新的AFP数据下降明显,均不支持肝癌诊断,所以活动性肝炎可能性更高。其影像学和病理学均提示肝硬化表现,进而排查肝硬化的可能病因:患者女性,无饮酒史,排除酒精性脂肪肝;HV-M阴性,CMV+EBV 阴性,排除病毒性肝炎;无长期用药及毒物接触史,排除药物或中毒性肝炎;无其他免疫相关疾病,多次查自免肝抗体阴性,排除自身免疫性肝病。患者体型瘦,BMI低,血糖、血脂、尿酸正常,临床表现不明显,排除了诸多肝硬化的病因,再结合肝细胞大泡性脂肪变性的病理结果,综合考虑WD的可能性较大。随后完善了WD相关特异性检查(铜蓝蛋白、眼角膜K-F环、血清铜、24h尿铜含量、头颅CT等),并进行了基因检测。基因分析结果显示ATP7B基因突变c.3316G>A 和c.2333G>T的复合杂合子;蛋白结构预测分析显示突变c.2333G>T是ATP7B蛋白的致病性突变。由于错义突变,导致蛋白质的三级结构发生变化,氢键的位置和数量明显改变,最终出现氨基酸的错译。ATP7B 基因 Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)错义杂合突变,致2333位鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)[9],致所编码的蛋白质第778位氨基酸由精氨酸(Arg)变为亮氨酸(Leu)。文献报道该变异降低了细胞内铜离子的外排作用,并影响ATP7B蛋白在细胞内的定位和运输,综合考虑,认为该变异为致病性变异。Exon15 c.3316G >A p.(Val1106 Ile)错义杂合突变,致3316位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A),致翻译产物蛋白质第1106位氨基酸残基由缬氨酸(Val)变为异亮氨酸(Ile)。Val1106位点虽位于保守序列,但属于罕见的多态性位点,影响WD患者的表现度,也有研究显示该变异对其功能无显著影响。综合考虑,该变异的临床意义未明。有研究发现WD的基因型和表型存在一定的相关性,其中R778L突变可能与较早的发病年龄、低水平的血清铜蓝蛋白有关,也可能与更严重的肝功能损伤有关[10,11]。本例患者存在R778L突变, 是肝豆状核变性疾病的热点之一。

综上所述,本例WD患者以AFP升高为主要表现,其突变基因ATP7B(13q14) Exon15 c.3316G>A p.(Val1106Ile),ATP7B(13q14) Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)的发现为确诊、治疗以及家系遗传咨询提供了遗传学依据。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。