丁苯酞-两亲碳质微球材料的制备与表征

朱帝　李维　葛方兰　王丽瑶

摘要：制备两种型号的包埋了丁苯酞的两亲性碳质微球I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP，研究其包埋率和缓释性.先用丙酮对酵母细胞进行预处理，然后再将酵母细胞进行温和的水热碳化（180～200 ℃，8～12 h），取部分处理液直接烘干得到I-ACPs;其余处理液经硫酸处理数小时，清洗，离心，55 ℃烘干便得到II-ACPs;将I-ACPs和II-ACPs均匀分散于超纯水中，添加丁苯酞，常温下180 r/m振荡5 h，离心烘干便得到I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP.I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP制备成功，包埋效果好，且具有良好的两亲性和缓释性.I-ACPs@NBP的包埋率和缓释性要略优于II-ACPs@NBP.I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP可添加于水凝胶等医用敷料促进伤口愈合.

关键词：两亲性中空碳质微球; 丁苯酞; 制备; 包埋率; 缓释性

中图分类号：R318.08 文献标志码：A 文章编号：1001-8395（2023）05-0677-08

0引言

两亲性中空碳质微球由于在靶向给药、药物控释、催化、储能材料、固定化酶和环境吸附材料等领域的应用日益广泛，引起了人们的关注[1-2].这是由于两亲性中空碳质微球具有能够有效封装活性成分（如染料、药物、墨水、细胞和蛋白质）到内腔中的优良特性[1].又由于微球表面层分子具有特定的官能团，可以使其具有更好的物理和化学性质（如超疏水性、超亲水性和两亲性）[1].酿酒酵母细胞是制备具有可控孔隙度空心碳质微球的良好材料，对酵母细胞进行温和的水热处理（180～200 ℃），可合成具有可控中孔和大孔的中空碳质微球（amphiphilic hollow carbon microspheres，ACPs）[1].在水热条件下，微球表面碳化形成了部分疏水性基团，同时又保留了酵母细胞壁本身的亲水性基团[2]，这些空心球的表面同时被疏水和亲水官能团覆盖，使所获得的微球具有两亲性.此外，两亲性使得多孔中空碳质球（ACPs）表现出相转移、蛋白质自富集和pH控制释放行为[1].为了合成ACPs，首先用丙酮预处理酵母细胞，确保去除细胞内原生质体.再加入戊二醛（GA）作为保护剂[1]，戊二醛通过共价键结合细胞壁多糖网络中的醛基或酰胺基，增强了多糖网络的强度，从而避免了不必要的断裂[1]，使细胞壁多糖网络免遭破坏.研究表明，当加入体积分数2%戊二醛水溶液时，微球表面的孔径平均尺寸约为43 nm，进一步经硫酸处理后，尺寸增大到50 nm，在部分样品中甚至可以明显看到大于100 nm的大孔[1].

丁苯酞（dl-3-n-Butylphthalide，NBP）为dl-3-正丁基-1（3H）-异苯并呋喃酮，与从芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素具有相同的结构，是人工合成的消旋体[3-4].丁苯酞在229 nm波长处有最大吸收峰[5]，临床上常用于治疗急性缺血性脑卒中[6].丁苯酞能促进血管再生[7-8].丁苯酞化学结構见图1所示.

丁苯酞（NBP）为黄色液体，微溶于水，可溶于甲醇、乙醇以及DMSO等有机溶剂[5].ACPs具有两亲性，能将丁苯酞包埋在微球内部，同时ACPs表面也能吸附丁苯酞.将NBP包埋于ACPs内部即形成ACPs@NBP，再将ACPs@NBP加入到水凝胶等医用敷料中，可以促进伤口的血管生长，加快伤口愈合，并且ACPs@NBP具有缓释性，可以长时间慢慢释放NBP，以便药物充分吸收.因此，本实验制备的包埋了丁苯酞的两亲性碳质微球ACPs@NBP，可应用于水凝胶等医用敷料的制作.

1材料与方法

1.1实验试剂 安琪啤酒活性干酵母;丙酮（分析纯，质量分数≥99.5%，成都市科龙化工试剂厂）;无水乙醇（分析纯，质量分数≥99.7%，成都金山化学试剂有限公司）;戊二醛（AR 50%，罗恩试剂）;0.5 mol/L的NaOH水溶液（实验室自配）;丁苯酞（石家庄多维化工有限公司）.

1.2实验仪器 纯水超纯水一体机（型号：arium comfort I，赛多利斯上海贸易有限公司）;电子天平（AR224CN，奥豪斯仪器上海有限公司）;数显控温加热搅拌器（常州市金坛大地自动化仪器厂）;冷冻高速离心机（Allegra X-30R，美国贝克曼库尔特有限公司）;箱式电阻炉（SX2-4-10A，绍兴市上虞道墟科析仪器厂）;KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;双层恒温振荡器（IS-RSV1，上海恒科学仪器有限公司）;恒温摇床（DHZ-CA，太仓市实验设备厂）;100 mL水解管（安徽韦斯实验设备有限公司）;紫外可见分光光度计（BioMate 3S，赛默飞世尔科技公司）;透析袋（MW：14 000，biosharp公司）.

1.3中空碳质微球的制备与表征分析

1.3.1中空碳质微球ACPs的制备 本实验制备了两种不同表面孔径大小的碳质微球：I-ACPs和II-ACPs，II-ACPs是I-ACPs经过硫酸处理后形成的.

1.3.2I-ACPs的制备 称取20 g啤酒酵母溶解于200 mL超纯水，用磁力搅拌器搅拌均匀（约1 h）后离心（8 000 r/m，8 min）得到沉淀（酵母细胞），弃去上清液，加入丙酮，用玻璃棒搅拌，使沉淀分散均匀，并置于恒温振荡器常温180 r/m振荡15 min，8 000 r/m离心8 min，弃去上清液[1，9].重复此操作2次，以除去酵母细胞的原生质体.用超纯水悬浮沉淀，均匀分散后，8 000 r/m离心8 min，弃去上清液，收集沉淀物.重复此操作2次，以去除黏附在细胞壁上的原生质体.再将沉淀均匀分散于体积分数为2%的戊二醛水溶液中[1，9]，倒入水解管中，将水解管放入箱式电阻炉中，加热至180～200 ℃保持8～12 h，使酵母细胞壁受热碳化.冷却后取出水解管，摇匀，离心（8 000 r/m，12 min），弃去上清液，取褐色沉淀，用体积分数50%乙醇溶液数次清洗离心（8 000 r/m，12 min），直至上清洗液接近无色，以去除戊二醛、色素及各种有机和无机杂质，得到较为干净的褐色沉淀[1，9].将其置于烘箱中（55 ℃）烘干，所得产物即为两亲性碳质微球，称重为2.42 g.

1.3.3II型碳质微球（II-ACPs）的制备 称取一定量的I-ACPs，置于质量分数为20%～50%的硫酸溶液中，在室温下处理数小时[1]，8 000 r/m离心12 min，清洗，用0.5 mol/L的NaOH溶液调节PH值至7.0，再离心（8 000 r/m，12 min），55 ℃烘箱中烘干即可得到II-ACPs.

2实验结果与分析

2.1中空碳质微球ACPs的表征分析 对本研究所获得的微球材料进行扫描电子显微镜（SEM）分析，结果如图2所示.从图2中可以看出，II-ACPs表面的小孔孔径比I-ACPs表面的要大.I-ACPs的微球表面孔径为43 nm左右;II-ACPs是I-ACPs经过硫酸处理后的产物，微球表面孔径大约为50～100 nm，部分微球甚至会超过100 nm，形成较大的孔径.

2.2两亲性碳质微球对丁苯酞的扫描电子显微镜与缓释分析 分别称取0.2 g I-ACPs和II-ACPs，分别加入10 mL超纯水，超声处理10 min，使其均匀分散[10]，再分别加入0.2 ml丁苯酞，置于摇床上振荡5 h[10].离心（8 000 r/m，8 min），收集沉淀，放入55 ℃烘箱中，烘干，得I-ACPs@NBP或II-ACPs@NBP.

2.2.1扫描电子显微镜（SEM）分析 对本研究所获得的包埋了丁苯酞的微球材料进行扫描电子显微镜（SEM）分析，结果如图3所示.从图3b、c、e、f中，可以看出I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP的表面均致密地附着了丁苯酞，说明本研究制备的I-ACPs和II-ACPs都能够很好地吸附丁苯酞.

2.2.2I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP的NBP缓释分析 首先绘制丁苯酞的标准曲线.准确量取5.9 μL的NBP（即10.03 mg），置于50 mL容量瓶中，以体积分数50%的乙醇水溶液为溶剂，进行定容.分别取上述溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mL置于10 mL容量瓶中，用体积分数50%的乙醇水溶液稀释，定容[11]，然后以体积分数50%的乙醇水溶液为空白，于229 nm波长下，分别测定各浓度梯度溶液的吸光度，如表1所示.

以NBP的吸光度对NBP质量浓度作图，结果如图4所示，得到标准曲线：y=36.821x-0.033 4，R²=0.999 3，说明NBP在0.006～0.018 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好.

取透析袋，相继用体积分数50%乙醇，0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用超纯水漂洗4次，以除去生产过程中产生的极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质.所用透析袋的截留分子质量为14 000，能透过水，乙醇和丁苯酞的小分子物质（丁苯酞分子质量为190.238），由酵母细胞壁碳化得来的碳质微球不能透过.

称取一定量的I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP，分别溶于20 mL的体积分数50%乙醇水溶液，并转入透析袋中，将透析袋置于装有300 mL的体积分数50%乙醇水溶液的锥形瓶中，在摇床中180 r/m振荡，每隔1 h取样，于229 nm波长下检测吸光度，检测后，样品要倒回锥形瓶.I-ACPs@NBP的缓释情况如图5所示，在第10 h时曲线开始趋于平稳，锥形瓶中体积分数50%的乙醇水溶液中的NBP质量浓度接近最大值，说明I-ACPs@NBP中包埋的NBP基本释放于体积分数50%的乙醇水溶液中，有效缓释时间为10 h，15 h后完全缓释完毕.这说明NBP成功包埋于I-ACPs中，且具有缓释性.

II-ACPs@NBP的缓释情况如图6所示，在第8 h时锥形瓶中体积分数50%的乙醇水溶液中的NBP质量浓度达到最大，完全缓释完毕，说明II-ACPs@NBP的有效缓释时间为8 h，NBP亦成功包埋于II-ACPs中，也具有缓释性.I-ACPs@NBP的10 h的缓释时间要略优于II-ACPs@NBP的8 h缓释时间.

2.3热失重（TGA）分析 热失重（TGA）由四川大学分析测试中心分析.分别称取4种实验样品，包括I-ACPs@NBP、空载对照I-ACPs、II-ACPs@NBP、空载对照II-ACPs，通入氮气，流量为50 mL/min，以10 ℃/min的速度升温到1 000 ℃[9，12].

图7～10分别是I-ACPs@NBP、空载对照I-ACPs、II-ACPs@NBP和空载对照II-ACPs的热失重分析结果.4个实验样品称取的质量分别是7.939 0、7.924 0、7.768 0和7.841 0 mg.

对比图7和8，可知图7中的第2个台阶和图8中的第2个台阶都是I-ACPs受热失重的过程，在300～550 ℃这一升温范围内.图7中的第1个台阶是I-ACPs@NBP中包埋的NBP受热失重的过程，在100～300 ℃這一升温范围内，失重率达53.98%，即4.29 mg，说明7.939 0 mg的I-ACPs@NBP中包埋了4.29 mg的NBP，包埋率达到53.98%，即1 g的I-ACPs能包埋539.8 mg的NBP，包埋效果相当高.

对比图9和10可知，图9中的第2阶梯和图10中的第2阶梯都是II-ACPs受热失重的过程，在300～550 ℃这一升温范围内.图9中的第1个台阶是II-ACPs@NBP中包埋的NBP受热失重的过程，也在100～300 ℃升温范围内，失重率达50.66%，即3.94 mg，说明7.768 0 mg的II-ACPs@NBP中包埋了3.94 mg的NBP，包埋率达到50.66%，即1 g的II-ACPs能包埋506.6 mg的NBP，包埋效果好.从图11能更直观地看出4个样品失重变化的异同对比.I-ACPs@NBP的包埋率略优于II-ACPs@NBP.

2.4I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP两亲性测试 将I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP分别融入超纯水、丙酮、甲苯、氯仿、DMF和超纯水氯仿混合液中，观察各自分散情况[9-10，12].

从图12和13中可以看出，I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP均能很好地分散于极性溶剂和非极性溶剂中，在超纯水氯仿混合液中，I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP微粒均聚集在水和氯仿之间.证明了I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP都具有很好的两亲性.

图12从左至右a、b、c、d、e、f样品溶剂依次为超纯水、丙酮、甲苯、氯仿、DMF、超纯水氯仿混合液（上层为超纯水下层为氯仿）.图13从左至右h、i、j、k、l、m样品溶剂依次为超纯水、丙酮、甲苯、氯仿、DMF、超纯水氯仿混合液（上层为超纯水下层为氯仿）.

3结论

中空碳质微球具有良好的两亲性和缓释性，作为载体可以用于包埋各种药物，目前相关研究报道还不多.最近，有人报道采用中空碳质微球包埋抑菌性物质[9-10]，并添加在凝胶剂中，结果具有很好的缓释性和长久抑菌性.受此启发，本研究成功制备了两种型号的包埋了丁苯酞的两亲性碳质微球，分别为I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP.实验结果表明，丁苯酞成功包埋于I-ACPs和II-ACPs内部，微球表面也能附着一层致密的丁苯酞，说明包埋效果良好;另外，它们还具有很好的两亲性和缓释性，I-ACPs@NBP的缓释性和包埋率略优于II-ACPs@NBP.总的来说，I-ACPs@NBP的总体性能要优于II-ACPs@NBP.I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP均可用于水凝胶等医用敷料的制备，延长NBP缓释时间，有利于促进血管的生长，促进伤口愈合.还由于I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP具有两亲性，能够均匀地分布在水凝胶医用敷料中.另外，除包埋丁苯酞外，两亲性中空碳质微球亦可以同时包埋表皮生长因子等小分子蛋白质，再添加于水凝胶或水胶体等医用敷料，赋予医用敷料多种医疗功能.

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Preparation and Characterization of Butylphthalide-Amphiphilic Hollow

Carbon MicrospheresZHU Di LI Wei GE Fanglan WANG Liyao

MA Xiaojuan YANG Sen HU Han （1. College of Life Science， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， Sichuan;

2. Key Laboratory of Biological Resources of Sichuan Province， Chengdu 610101， Sichuan）

Abstract：Two types of amphiphilic hollow carbon microspheres embedded with butylphthalide I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP were prepared to study their embedding rates and slow release features. The yeast cells were pretreated with acetone， and then carbonized under mild hydrothermal conditions（180-200 ℃， 8-12 h）. Part of the conditioning fluid was directly dried to obtain I-ACPs.The other conditioning fluid was treated with sulfuric acid for several hours， cleaned， centrifuged and dried at 55 ℃ to obtain II-ACPs. The I-ACPs and II-ACPs were evenly dispersed in ultra-pure water， with butylphthalide added and shaken at 180 r/m for 5 h at room temperature， and then I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP were obtained by centrifugal and drying. I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP were successfully prepared with good embedding effects， good amphipathies and slow release features. The embedding rate and slow release feature of I-ACPs@NBP are slightly better than that of II-ACPs@NBP. I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP can be added to hydrogel and other medical dressings to promote wound to heal.

Keywords：amphiphilic hollow carbon microspheres; butylphthalide; preparation; embedding rate; slow release feature

（編辑 郑月蓉）