两种桉树叶挥发物对蚕豆根尖细胞有丝分裂行为的影响

王强　孟巧巧　王煜　马丹炜

摘要：桉树挥发物对周围植物具有化感抑制效应，为了探讨其化感作用机制，以蚕豆为实验材料，探究蓝桉和巨桉两种常见桉树叶挥发油及其两种主成分α-蒎烯和桉油精对蚕豆的遗传毒性.结果表明：在两种桉叶挥发油及其主要成分作用下，蚕豆幼根长仅在最低处理梯度时（24和48 h）显著大于对照组（P＜0.05），其余处理组均呈现剂量-时间依赖性抑制效应，α-蒎烯与两种桉叶挥发油的作用效应更为相似;桉叶挥发物在一定范围内干扰了蚕豆根尖细胞的有丝分裂过程，表现为细胞出现微核和多种类型的染色体畸变，有丝分裂指数下降，微核率升高，并表现出剂量-时间依赖效应，但微核率低于正常细胞的本底值.整体来看，两种桉叶挥发物的遗传毒性较小，因此两种桉树通过挥发途径的化感作用不是通过干扰有丝分裂而发挥功能的.

关键词：桉树; 化感作用; 挥发油; 遗传毒性

中图分类号：Q945 文献标志码：A 文章编号：1001-8395（2023）05-0685-08

桉树（Eucalyptus spp.）是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）植物的总称，原产于澳大利亚和东南亚[1]，已成为世界三大造林树种（松、桉、杨）之一[2].桉树已被120多个国家引种，占世界种植面积的1/3.据统计，我国桉树种植多达540万hm^2，占全国森林总面积的近2.5%[3]，主要用于造纸、制作人造板和提取精油[4].桉叶中含有大量的挥发性次生代谢物质，如桉油精、α-蒎烯、桉叶醇、柠檬烯、ρ-对伞花素、香茅醛和蓝桉醇等[5-6]，具有良好的杀虫驱虫、抗菌、消炎镇痛、抗氧化等生物活性，具有较大的经济价值[4].然而，近年来，桉树种植引起的土壤退化、林下生物多样性丧失、生态系统功能丧失等生态问题逐渐成为社会关注和学术界争论的热点问题[7-9].桉叶油对周围农作物也具有较强的化感作用，主要通过挥发和凋落物淋溶液等途径，尤其是叶凋落物淋溶液可大量产生酚酸、酯、烷烃等化感物质，改变土壤pH，显著抑制种子萌发和植物生长[10-11].根是植物吸收水分和矿质营养的主要器官，根际土壤直接关乎植物的生长状况，而根尖是根系生长、伸长和吸收最活跃的部位，根尖的健康状况直接关系植物生存[12].前人研究表明，植物释放的挥发性物质可被雨露带入土壤，或被土壤吸附并溶解到根细胞的角质中[13]，影响根尖细胞的有丝分裂行为并诱导遗传损伤[14]，干扰根的基因表达[15].那么，桉树化感作用是否通过干扰受体根尖有丝分裂行为，进而抑制生长发育呢？明确这一问题对科学评价桉树种植对生态环境的负面效应具有积极的理论价值和现实意义.本研究运用细胞毒理学评价常用的蚕豆根尖微核技术，以四川地区广泛种植的蓝桉（Eucalyptus globulus）和巨桉（Eucalyptus grandis）两种桉树叶挥发油及其二者共同成分桉油精和α-蒎烯为供体，研究了在桉叶挥发物作用下，蚕豆根尖细胞有丝分裂指数、畸变率和微核率的變化，旨在回答这一科学问题.

1材料与方法

1.1材料 蓝桉、巨桉叶采集于四川师范大学成龙校区及其附近街道，阴干备用;供试植物蚕豆种子（成胡14#）购自成都市龙泉驿区大面镇街道种子市场;实验所用标准品α-蒎烯（质量分数≥99%）和桉油精（质量分数≥99%）购自科赛斯特（成都）科技有限公司.

1.2挥发油提取、共有成分检测和处理梯度的设置 参照文献[16]的水蒸气蒸馏法略有改动，提取桉叶挥发油.将阴干后桉叶分别剪成小段，准确称取1 000 g，提取4 h，蓝桉挥发油得率为3.67%，淡黄色透明，具有芳香性气味;巨桉的挥发油得率为1.21%，淡黄色透明，具芳香性气味[17].无水Na₂SO₄除去水分，称重，4 ℃保存备用.采用Aglient 7890A/5975c气相色谱-质谱联用仪分别测定两种桉树挥发油的成分和相对含量.GC-MS检测表明，蓝桉和巨桉挥发油中含量最高的成分均为桉油精和α-蒎烯，桉油精的体积分数分别为59.55%、50.49%;α-蒎烯的体积分数分别为17.18%、17.89%.

本研究设置了4个处理组，即蓝桉叶挥发油、巨桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精，每组设置5个处理梯度（记为T1，T2，T3，T4和T5），α-蒎烯和桉油精的处理梯度与其在桉叶油中所占体积分数（59.55%和17.89%）相对应，以不做处理为对照（见表1）.

1.3材料培养和毒性试验 挑选大小均一、无病、无霉斑和颗粒丰满匀称的蚕豆种子，洗净，质量分数0.5%KMnO₄溶液消毒15 min，蒸馏水清洗3～5次，25 ℃培养箱中浸种24 h后，均匀铺在垫有湿纱布磁盘中，再覆盖1层湿纱布，放入25 ℃培养箱中避光培养至种子露白.将露白种子置于垫有湿润滤纸的培养瓶（直径6 cm，高度9 cm），每瓶3颗.按照表1分别取不同梯度的桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精，均匀涂抹在培养瓶盖上，并立即盖紧瓶盖，置于25 ℃的培养箱中避光培养24、48和72 h，以瓶盖未涂抹挥发物的处理作对照，每处理重复10次.处理结束后分为2组，一组用直尺测定根长（cm）;另一组换干净瓶盖恢复培养24 h后，参照王煜等[18]观察蚕豆根尖细胞有丝分裂和微核的方法略有改动.截取0.5 mm左右的根尖，卡诺固定液（体积比冰醋酸∶无水乙醇=1∶3）固定24 h.1 mol·L^-1HCl 60 ℃解离8 min，ddH₂O清洗3次，改良苯酚品红染液染色，压片，Nikon E200摄影显微镜观察并拍照，每次处理统计5个根尖，每个根尖计数1 000个细胞，重复3次，计算有丝分裂指数（mitotic index，MI）和微核率（micronucleus frequency， MCN）：

2结果与分析

2.1桉叶挥发物对蚕豆根生长的影响 根据图1可见，除了24 h处理组的最小梯度对蚕豆根的生长具有显著促进效应外，其余处理的根长均比对照短，且随着处理时间延长、处理梯度增加，处理组根生长受抑制程度加剧，在72 h处理组中，在蓝桉挥发油、巨桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精的最大梯度作用下，根长仅为对照组的22.48%、20.16%、22.87%和23.64%;形态学观察表明，挥发物处理组的幼根表现出明显的受害症状，如变短变粗，根冠变褐，根毛稀少等，这种症状随着处理梯度的增加和时间的延长而加剧，甚至出现变黑、烂根的情况;α-蒎烯和桉油精对蚕豆根生长的抑制效应与两种桉油接近，推测二者是桉油挥发油中的主要化感物质，根据非度量多维尺度分析（NMDS）结果表明（图2），α-蒎烯对蚕豆根生长的抑制效应与两种桉叶挥发油的效应更相似.

2.2桉叶挥发物对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响 桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精干扰了蚕豆根尖细胞有丝分裂过程（图3）.在不同处理时间，各处理组整体表现为处理梯度较低时（T1、T2和T3）有丝分裂指数升高，处理梯度较高时（T4、T5）有丝分裂指数下降.其中，在T1达到最高值，以24 h处理组的变化最为明显，在该处理时间段的T1处理组中，在蓝桉叶挥发油、巨桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精作用下，蚕豆根尖细胞的有丝分裂指数分别为10.02％、10.17％、10.17％和10.03％，与对照（8.09％）差异显著;在T5达到最低值，以72 h处理组的变化最为明显，在该处理时间段的T5处理组中，在蓝桉叶挥发油、巨桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精作用下，蚕豆根尖细胞的有丝分裂指数分别为4.05％、3.40％、4.36％和4.89％，与对照（7.71％）差异显著.各处理组的前期细胞所占比例较大，且随着处理梯度增大和处理时间延长，前期细胞数与有丝分裂指数的变化规律一致，均逐渐减少;处理梯度达到T5时，叶挥发油处理组有丝分裂指数已趋于平稳，表明根尖严重受损.

2.3桉叶挥发物的遗传毒性

2.3.1微核和染色體畸变 显微观察表明，在桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精作用下，蚕豆根尖细胞出现微核和染色体畸变现象（图4），间期细胞产生了单微核（图4a）、双微核（图4b）和多微核（图4c）现象;前期主要是微核和染色体断片;中期主要是微核、染色体断片（图4d）和纺锤体多极分裂（图4l）;后期主要是染色体断片（图4e）和染色体滞后（图4k）;末期主要是染色体断片（图4f）、游离环（图4g）、染色体桥（图4h）、染色体移动不同步（图4i）和染色体粘连（图4j）等，这些现象表明桉叶挥发物诱导了遗传损伤.

2.3.2桉叶挥发物诱导的蚕豆根尖细胞微核率 用微核试验技术检测染色体畸变及纺锤丝毒性程度.本研究结果表明（图5），在桉叶挥发物作用下，蚕豆根尖细胞中微核率变化趋势表现为先升高后降低，整体显著高于对照，在T4达到峰值，以48 h处理组的变化最为明显，在该处理时间段的T4处理组中，蓝桉叶挥发油、巨桉叶挥发油、α-蒎烯和桉油精作用下，蚕豆根尖细胞的微核率分别为9.39‰、10.30‰、9.23‰和7.46‰，与对照（2.21‰）差异显著，但低于正常细胞的本底值10‰[21-22]，因此遗传毒性效应较低.共有成分α-蒎烯和桉油精诱导微核产生的效应与叶挥发油相似，与对根长的抑制和有丝分裂的影响基本一致.

2.4桉叶挥发物对蚕豆根尖有丝分裂行为影响的综合比较 根据化感综合效应指数可知，4种挥发物化感综合效应由大到小依次为巨桉挥发油（0.37）＞蓝桉挥发油（0.33）＞α-蒎烯（0.31）＞桉油精（0.24），α-蒎烯和桉油精与两种挥发油的化感效应呈极显著的正相关关系（P＜0.01），表明二者是桉叶挥发油的主效化感物质.

3讨论

桉树富含次生代谢物质，这些物质释放到环境对周围植物产生化感作用，抑制周围植物的种子萌发和幼苗生长[10-11]，因此化感作用可能是桉树种植引起生物多样性下降的原因之一.研究表明，桉叶油富含多种化感物质，其中α-松油醇显著抑制反枝苋（Amaranthus retroflexus）种子发芽和生长[23].环境胁迫导致生物体基因组损伤[24]，干扰细胞周期相关蛋白基因的表达[25]，从而阻止纺锤丝微管蛋白的聚合和纺锤体的形成[26].当受胁迫程度超出了生物的耐受限度时，细胞自我修复DNA或染色体损伤的能力下降，形成染色体断片，发生断裂的染色体在机体免疫保护作用下形成染色体桥[27]，由于其无着丝点形成，也就导致了微核的出现[28].本研究结果表明，在两种桉叶挥发油及其共有成分α-蒎烯和桉油精的作用下，蚕豆根长和根尖细胞均表现为低浓度促进和高浓度抑制，大体为剂量-时间呈现双重效应，分裂细胞大部分处于分裂前期，这一结果与胡琬君等[29]研究土荆芥挥发油对蚕豆根尖细胞作用的结果相似，表明在较低浓度的桉叶挥发油刺激下，蚕豆根尖细胞出现应急反应，通过加速分裂以抵御桉叶挥发物的化感胁迫，但随着处理时间延长和处理浓度增加，胁迫强度加剧，超出了细胞应激反应的阈值，纺锤体形成过程受阻，细胞分裂被阻滞在分裂前期.同时，细胞内出现微核和各类染色体畸变现象，根尖细胞的微核率随着处理时间和处理浓度的增加而逐渐升高，与刘羽等[30]研究4种酚类物质诱导蚕豆根尖细胞微核率的变化趋势相似.正常情况下，细胞微核率的本底值约为10‰[21-22]，本研究4种桉叶挥发物诱导的微核率均在10‰以下，因此遗传毒性相对较低，生态风险较低，桉树挥发性化感物质对有丝分裂过程影响较小，可能通过其他途径产生化感胁迫.

4结论

蓝桉和巨桉的叶挥发物具有一定的遗传毒性，能干扰蚕豆根尖细胞有丝分裂过程，破坏纺锤体的形成和结构，导致细胞出现微核和各类染色体畸变，导致根系生长受阻，两种桉叶挥发油共有成分α-蒎烯和桉油精是其主效化感物质.但是，两种桉叶挥发物诱导的遗传毒性低于正常细胞10‰的本底值，表明其遗传毒性较小，桉树化感胁迫可能通过其他途径影响植物的生长过程.

参考文献

[1] QIN F C， LIU S， YU S X. Effects of allelopathy and competition for water and nutrients on survival and growth of tree species in Eucalyptus urophylla plantations[J]. Forest Ecology and Management，2018，424（15）：387-395.

[2] 马丽珍. 不同桉树品系在闽北地区造林成效研究[J]. 桉树科技，2016，33（1）：12-16.

[3] WU W X， CHEN S F. Species diversity， mating strategy and pathogenicity of calonectria species from diseased leaves and soils in the Eucalyptus plantation in southern China[J]. Journal of Fungi，2021，7（2）：73.

[4] 黄丽平，伍影瑶，赖俊杰，等. 桉属挥发油化学成分及其生物活性研究进展[J]. 天然产物研究与开发，2022，34（3）：505-539.

[5] TAMPE J， PACHECO B， BARDEHLE L， et al. Attractant effect of Eucalyptus globulus （Labill） and Foeniculum vulgare （Mill.） essential Oils on Aegorhinus superciliosus （Guérin） （coleoptera：curculionidae）[J]. Journal of Soil Science and Plant Nutrition，2020，20（2）：775-783.

[6] SPADACCINO G， FRABBONI L， PETRUZZI F， et al. Essential oil characterization of Prunus spinosa L. Salvia officinalis L. Eucalyptus globulus  L. Melissa officinalis L. and Mentha x piperita L. by a volatolomic approach[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2021，202（2）：114167.

[7] YANG X B， LI D H， MCGROUTHER K， et al. Effect of Eucalyptus forests on understory vegetation and soil quality[J]. Journal of Soils and Sediments，2017，17（9）：2383-2389.

[8] XIE Y J， ARNOLD R J， WU Z H， et al. Advances in eucalypt research in China[J]. Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2017，4（4）：380.

[9] ZHAO W， ZHENG Z， ZHANG J L， et al. Allelopathically inhibitory effects of Eucalyptus extracts on the growth of Microcystis aeruginosa[J]. Chemosphere，2019，225：424-433.

[10] PAIRO P E， RODRIGUEZ E E， BELLOCQ M I， et al. Changes in taxonomic and functional diversity of plants in a chronosequence of Eucalyptus grandis plantations[J]. Scientific Reports，2021，11（1）：10768.

[11] SONG Q M， QIN F C， HE H， et al. Allelopathic potential of rain leachates from Eucalyptus urophylla on four tree species[J]. Agroforestry Systems，2019，93（4）：1307-1318.

[12] HAWES M C， GUNAWARDENA U， MIYASAKA S， et al. The role of root border cells in plant defense[J]. Trends in Plant Science，2000，5（3）：128-133.

[13] 胡忠良，王亞男，马丹炜，等. 玉米根边缘细胞exDNA和胞外蛋白对土荆芥化感胁迫的缓解效应[J]. 中国农业科学，2015，48（10）：1962-1970.

[14] 胡琬君，马丹炜，王亚男，等. 土荆芥挥发油对蚕豆根尖细胞的氧化损伤[J]. 应用生态学报，2012，23（4）：1077-1082.

[15] 陈斌，王亚男，马丹炜，等. 土荆芥化感胁迫对玉米幼根抗氧化酶活性和基因表达的影响[J]. 生态环境学报，2015，24（10）：1640-1646.

[16] M?HLEN C V， ZINI C A， CARAMO E B， et al. Comparative study of Eucalyptus dunnii volatile oil composition using retention indices and comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled to time-of-flight and quadrupole mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2008，1200（1）：34-42.

[17] 孟巧巧，岳海燕，张玉琴，等. 成都地区3种桉树叶挥发油成分与体外抗肿瘤活性的初步研究[J]. 西南农业学报，2020，33（3）：540-546.

[18] 王煜，王亚男，张红，等. pH与铝对蚕豆根尖细胞有丝分裂的交互作用[J]. 四川师范大学学报（自然科学版），2012，35（3）：400-404.

[19] WILLIAMSON G B， RICHARDSON D. Bioassays for allelopathy：measuring treatment responses with independent controls[J]. Journal of Chemical Ecology，1988，14（1）：181-187.

[20] 申时才，徐高峰，张付斗，等. 红薯叶片浸提液对5种主要农田杂草种子萌发及幼苗生长的化感作用[J]. 生态学报，2017，37（6）：1931-1938.

[21] 莫金钢，宋思闻，张丽辉，等. 醋酸铅对蚕豆根尖细胞微核率的影响[J]. 福建农业学报，2017，32（8）：905-908.

[22] 臧宇，薛开先. 蚕豆根尖微核试验的应用与发展[J]. 癌变·畸变·突变，1999，11（3）：158-160.

[23] 李奥欣，侯新村，曾加佳，等. 桉树油化学成分分析及α-松油醇的化感作用[J]. 应用生态学报，2020，31（7）：2195-2201.

[24] HU Y， TAN L， ZHANG S H， et al. Detection of genotoxic effects of drinking water disinfection by-products using Vicia faba bioassay[J]. Environmental Science and Pollution Research，2017，24（2）：1509-1517.

[25] BOER B， MURRAY J. Triggering the cell cycle in plants[J]. Trends in Cell Biology，2000，10（6）：245-250.

[26] FUSCONI A， GALLO C， CAMUSSO W. Effects of cadmium on root apical meristems of Pisum sativum L.：cell viability， cell proliferation and microtubule pattern as suitable markers for assessment of stress pollution[J]. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2007，632（1/2）：9-19.

[27] 毛学文，王弋博，陈荃. 洗涤剂对蚕豆根和叶片的作用[J]. 广西植物，2003，23（2）：185-187.

[28] CODD R， DILLON C T， LEVINA A， et al. Studies on the genotoxicity of chromium：from the test tube to the cell[J]. Coordination Chemistry Reviews，2001，216/217：537-582.

[29] 胡琬君，马丹炜，王亞男，等. 土荆芥挥发油对蚕豆根尖细胞的化感潜力[J]. 生态学报，2011，31（13）：3684-3690.

[30] 刘羽，罗瑭秋琦，张亮，等. 4种酚类物质对蚕豆根尖细胞的遗传毒性研究[J]. 环境科技，2019，32（1）：7-11.

Genotoxic Effects of the Leaf Volatiles of Eucalyptus Globulus and

Eucalyptus Grandis on Vicia faba L. Root Tip CellsWANG Qiang，MENG Qiaoqiao，WANG Yu，MA Danwei（College of Life Sciences， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， Sichuan）

Abstract：Eucalyptus volatile has the allelopathic inhibitory effect on surrounding plants. In order to explore the allelopathy mechanism of Eucalyptus， the genotoxicity of volatile oils from Eucalyptus globules and Eucalyptus grandis and their two common components α-pinene and eucalyptol to broad bean （Vicia faba L.） were studied. The results showed that the root lengths of broad bean in most treatment groups were significantly shorter than those in control except the lowest treated dose group for 24 h and 48 h when exposed to Eucalyptus volatiles. Among them， α-pinene and the two volatile oils of Eucalyptus leaves had similar effects. To some extent， Eucalyptus volatiles interfered with the mitotic process of broad bean root tip cells， showing micronucleus and various chromosome aberrations， the decrease of the mitotic index and the increase of the micronucleus rate increased， which were dose-time dependent effects. But the micronucleus rates were lower than the background value of normal cells. These results suggested that the genotoxicity of Eucalyptus volatiles did not play a significant role in their allelopathy.

Keywords：Eucalyptus; allelopathy; volatile oil; genotoxicity

（编辑 郑月蓉）