喷施污泥热碱液对叶菜产量及氮转化酶的影响

吴晨瑞，薛晓蓉，王永亮，白炬，郭彩霞，杨治平，张强*

（1.山西农业大学，太原 030031；2.土壤环境与养分资源山西省重点实验室，太原 030031）

氮素是作物吸收量最多的元素之一，也是高等植物不可或缺的营养元素。植物不仅可以将无机氮同化为有机氮从而合成氨基酸等蛋白质，而且部分有机氮可以为植物提供氨基酸及生长发育所需氮源[1-2]，部分小分子肽也可被作物完全吸收，从而提高氮素利用率[3-4]。与化肥相比，氨基酸类肥料可以改善土壤的理化性质，并且含有多种生物活性化学物质，可提高蔬菜作物的养分利用效率、产量和品质，降低农药成本，保护环境[5]。而污泥中含有大量的蛋白质、氨基酸类物质，目前污泥通过高温热碱水解可生产出富含多肽、蛋白质、氨基酸的优质液体（热碱液）[6]，其中蛋白类物质含量高达30%~50%[7-8]，可以对作物起到积极作用且无毒性，为污泥的资源化、可持续化利用提供了新的思路。但是该液体对作物中氮素吸收转化的影响及其作用机制还鲜有研究。

根据对氨等各种氮的吸收和同化研究，叶面施用氨基酸可以提高土壤中氮素吸收效率，减少氮的淋溶[9-11]。多项研究表明，叶面喷施氨基酸类叶面肥对番茄产量和大豆植株干物质、叶绿素积累有显著促进作用[12-16]。也有研究表明，从污水、污泥中提取的含氮植物促生养分和植物促生生物刺激素液体的使用提高了大豆产量[6]。前人研究主要集中于氨基酸类叶面肥对作物生长发育的影响，但对作物氮素吸收及氮同化机制影响的研究还比较匮乏。

随着城市人口的增加，污泥数量也在大幅增加[17]，污泥虽然含有丰富的营养元素，但由于其存在病原体、可腐烂有机物和重金属等有害物质无法直接用于农业生产，从而造成污泥资源化利用程度低[18-19]。有研究表明热碱液不仅可以提取污泥中氨基酸等营养物质，还可以改善植物的生长，极大降低污泥中有机污染物和重金属元素的累积[20-21]，不引起重金属污染和土壤盐碱化[6]。相关研究表明，合理稀释倍数的叶面氨基酸性肥料施用能够对作物生长起到关键作用[22]。同时，圣亚男等[23]的研究表明叶面喷施稀释1 000倍的氨基酸水溶肥提高生菜产量及品质的效果最显著；范蓓蓓[24]的研究也表明，当浓缩沼液稀释250 倍时对小白菜的产量和品质有明显效果，而油麦菜以稀释100 倍最适宜。但关于热碱液在农业蔬菜应用中最佳稀释倍数及对作物氮素吸收影响的研究还暂无报道。

因此，本研究将不同稀释倍数的热碱液以叶面喷施的方式运用于农业蔬菜生产，通过监测在喷施不同稀释倍数热碱液条件下小青菜的生长发育及氮素吸收转化相关酶活性，探明其对作物生长及养分吸收的作用机理。旨在为热碱液对叶菜类作物氮素的作用机理研究提供理论基础，为其在蔬菜生产中的合理施用提供数据支撑，并为我国污泥的资源化、无害化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验基本信息

本试验在山西农业大学龙城校区温室（37°46'40″N，112°34'43″E）中进行，供试盆栽土壤采集于太原市清徐县专业种植合作社菜园（37°36'14″N，112°20'44″E），该地区有5 a 的蔬菜种植史，主要以种植小白菜为主，属于温带大陆性气候，年平均气温为10.2~10.6 ℃，年均降水量为500 mm 左右，土壤类型为砂质壤土，基础理化性状为：全氮0.125 g·kg-1、有效磷8.56 mg·kg-1、速效钾136.00 mg·kg-1、有机质14.85 g·kg-1、pH 7.85。

供试蔬菜为小青菜（Brassica chinensis），品名为夏多美（北京农种公司）。氮肥为尿素（含N 46%）、磷肥为过磷酸钙（含P2O516%）、钾肥为硫酸钾（含K2O 50%）。本研究委托山西晋联环科科技有限公司，在pH 13、温度为140 ℃、污泥含水率为91%和时间为3 h 的条件下将污泥放入高压反应釜中，加入一定量的去离子水调节其含水率并搅拌均匀，用CaO粉末调节pH，设定反应温度，进行搅拌，当釜内温度达到设定温度后开始计时，之后分离浓缩，进行热碱液的制备[25]，热碱液的主要成分如表1 所示，且重金属含量远低于《中华人民共和国国家标准肥料中有毒有害物质的限量要求》（GB 38400—2019）与《中华人民共和国农业行业标准含氨基酸水溶肥料》（NY 1429—2010）。

1.2 盆栽试验设计

本试验以喷施等量清水为对照（CK），热碱液先用柠檬酸调至中性后分别稀释至200 倍（T1）、400 倍（T2）、600 倍（T3）、800 倍（T4）和1 000 倍（T5），共6 个处理，每个处理、每个时期各重复3次，共54盆。用内径21.5 cm、高15 cm 的塑料盆进行盆栽试验，每盆装填供试土壤2.5 kg，各处理施用基肥（氮素120 mg·kg-1、P2O5100 mg·kg-1、K2O150 mg·kg-1）后，平衡3 d，灌水，使土壤孔隙含水量（WFPS）保持在60%。每盆播12 粒种子，待长出3 片叶后开始定苗，每盆定苗3株，定苗后每隔7 d 进行一次喷施处理，共喷施6 次。分别在定苗后每隔两周从对应时期盆栽内进行一次地上部样品的采集，到收获共取样3 次。于2021 年8月10 日播种，9 月26 日采收。试验期间的平均温度为（25±5）℃，所有植株在病虫害防治方面的处理方式相同。

1.3 测定项目

1.3.1 常规指标测定

小青菜每次样品采收后称取鲜质量作为其产量，部分样品在105 ℃下杀青30 min，70 ℃下烘干至质量恒定后称干质量作为其干物质量，粉碎过60 目筛（孔径0.25 mm）后，用Kjeldahl 法测定植株全氮含量。剩余样品保存至-80 ℃环境中，用于酶活性测定。叶片叶绿素相对含量（SPAD值）采用SPAD-502仪测定[26]。

1.3.2 氮素吸收转化相关酶活性测定

采用酶联免疫吸附法测定小青菜中的硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）的活性。分别称取0.1 g 小青菜样本，加入1 mL提取液，冰浴研磨，离心后提取上清液于96 孔UV 板中，加入试剂后在不同吸光度条件下用酶标仪进行酶活性测定。NR、GDH、GOGAT、GS 试剂盒购买于北京索莱宝生物有限公司，NiR 试剂盒购买于上海酶联生物有限公司。

1.3.3 参数计算及数据统计分析

氮素吸收效率（g·g-1）=氮素吸收总量/供氮量×100%[27]

氮素利用率（%）=（氮素吸收量-对照组氮素吸收量）/供氮量[27]

采用SPSS 23.0 软件进行方差分析，均值以最小显著性差异法进行检验。采用Origin 2018制图，偏最小二乘路径（PLS-PM）模型利用R 语言中“plspm”软件包进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同稀释倍数热碱液对小青菜SPAD 和生物量的影响

小青菜SPAD 在整个生育期内呈先升高后降低的趋势（图1a），喷施不同稀释倍数的热碱液处理较CK 均能显著提高SPAD 值，其中T2、T3 处理的SPAD值在整个生育期内均保持较高水平，分别比CK 处理高出10.02%、9.05%。

图1 喷施不同稀释倍数热碱液处理对各时期小青菜SPAD和干物质量的影响Figure 1 Effects of different concentrations of alkaline thermal hydrolysis liquid spraying treatments on SPAD and dry matter quality in Brassica chinensis in different periods

小青菜干物质量在整个生育期内呈升高趋势（图1b），喷施不同稀释倍数的热碱液处理较CK均能显著提高干物质量，且与其他喷施处理相比，T2 处理在整个生育期内保持较高的生物量水平，3 次采样分别高出7.14%~33.66%、15.79%~61.96%和13.54%~24.38%，并且可提高小青菜前期生长发育速率，加快作物生长。

2.2 不同稀释倍数热碱液对小青菜产量和氮素吸收利用的影响

与CK相比，不同稀释倍数条件下小青菜的产量、地上部氮素累积量均有所提升（表2），分别增加0.86%~24.38%和7.87%~45.85%。产量、地上部氮素累积量随着喷施热碱液稀释倍数的增加呈先增加后降低的趋势，在T2处理中达到最高值，分别比其他喷施处理增加13.54%~23.31%和10.56%~35.21%。

表2 喷施不同稀释倍数热碱液对小青菜产量、氮素吸收利用的影响Table 2 Effects of yield,nitrogen absorption and utilization in Brassica chinensis at different stages of different concentration of alkaline thermal hydrolysis liquid spraying treatments

随着喷施热碱液稀释倍数的增加，氮素吸收效率及氮素利用效率均呈先增加后降低的趋势（表2），但均高于CK 处理。在T2 处理中，氮素吸收效率、氮素利用效率达到峰值，分别比其他喷施处理增加10.56%~45.85%和13.54%~24.38%，说明喷施稀释倍数为400 倍的热碱液对小青菜氮素的吸收利用有显著效果。

2.3 不同稀释倍数热碱液对小青菜氮素同化相关酶活性的影响

2.3.1 硝态氮同化酶活性

在定苗后第二周、第四周和第六周时，小青菜NR 活性随着喷施热碱液稀释倍数的增加呈现先升高后下降的趋势（图2a），但均显著高于CK 处理。在T2 处理中，小青菜的NR 活性最高，在第二周、第四周和第六周时分别比其他喷施处理增加10.43%~89.12%、13.21%~63.62%和7.01%~64.21%。同时，在定苗后第二周，各喷施热碱液处理中T2 与T3、T4 和T5 均有显著差异，在定苗后第四周，T2 与T4 和T5 均有显著差异，但在第六周后喷施热碱液处理间无显著差异，说明喷施热碱液稀释倍数为400 倍的处理能够在小青菜生长前四周内提高NR 活性，这可能是由于热碱液中小分子有机物质为氮代谢提供了能量和碳骨架，加强了碳代谢，从而提高了NR活性[28]。

在定苗后第二周、第四周和第六周中，小青菜NiR 活性随着喷施热碱液稀释倍数的增加而呈现先升高后下降的趋势（图2b），但均显著高于CK 处理。在T2 处理中，小青菜的NiR 活性最大，在第二周、第四周和第六周时分别比其他处理增加3.53%~61.36%、7.42%~33.41%和4.27%~44.33%。同时，随着喷施热碱液稀释倍数的增加，在定苗后第二周，各喷施热碱液处理中T2 与T3、T4 和T5 均有显著差异，在定苗后第四周，T2 与T1、T3、T4 和T5 均有显著差异，在定苗后第六周，T2 与T3、T4 和T5 均有显著差异，说明喷施热碱液稀释倍数为400 倍的处理能够提高NiR 活性，从而促进对氮素的吸收利用。并且，不同时期和不同稀释倍数均对NR、NiR有交互影响。

2.3.2 氨态氮同化酶活性

在定苗后第二周、第四周和第六周时，小青菜GDH 活性随着热碱液稀释倍数的增加，呈先升高后降低的趋势（图3a），但均显著高于CK 处理。T2 处理中，小青菜GDH 活性达到峰值，在第二周、第四周和第六周时分别比其他喷施处理增加13.31%~62.95%、14.08%~70.47%和3.08%~39.43%。定苗后小青菜体内GDH 活性随生长发育呈上升趋势，但在第六周时，各热碱液处理间无显著差异，说明小青菜喷施热碱液可显著加快作物体内GDH 活性的升高速率并在后期保持较高水平，其中稀释倍数为400 的倍处理可在较短时间内提高作物体内GDH 活性，以促进作物对谷氨酸的合成，提高作物对氮素的吸收同化。

图3 喷施不同稀释倍数热碱液处理下各时期小青菜中谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性Figure 3 Glutamate dehydrogenase（GDH）,glutamate synthase（GOGAT）and glutamine synthase（GS）activities in Brassica chinensis at different stages of different concentration of alkaline thermal hydrolysis liquid spraying treatments

小青菜在定苗后第二周，各处理间GS 活性无显著差异，在第六周，T1和T2处理显著高于CK，其余各处理与CK 无显著差异。在第四周，GS活性随着喷施热碱液稀释倍数的增加，呈先增加后下降的趋势（图3b），在T2 处理中达到最高值，分别比其他喷施处理显著增加3.11%~62.78%，说明在该时期内喷施热碱液可明显提高小青菜中GS 活性，并且在稀释倍数为400 倍时效果最好。在小青菜定苗后第二周、第四周和第六周中，随着喷施热碱液稀释倍数的增加，GO⁃GAT 活性呈先升高后下降的趋势（图3b），T2 处理分别比其他喷施处理显著增加56.91%~74.67%、19.46%~53.79% 和30.46%~79.39%，从而促进GSGOGAT 循环，提高氮素的吸收利用。定苗后小青菜体内GS 活性随生长发育呈先上升后下降的趋势，但在第四周时喷施热碱液处理与CK 处理有显著差异，说明稀释倍数为400 倍的喷施热碱液可提高小青菜体内GS 活性峰值，促进谷氨酰胺的形成。定苗后小青菜体内GOGAT 活性随生长发育呈稳定状态，但在稀释倍数为400 倍条件下显著高于其他处理，并在小青菜整个生育期可保持较高值，以此保持对氮素较高水平的吸收转化。

总体而言，在小青菜生长发育期间喷施热碱液可明显提高小青菜中GDH、GOGAT、GS 活性，并且在稀释倍数为400 倍时效果最佳，从而提高了小青菜对氮素的同化。并且不同时期和不同稀释倍数均对GDH、GS和GOGAT有交互影响。

2.4 偏最小二乘路径分析（PLS-PM）

由图4a可知，为了最大限度解释各种酶对小青菜氮素吸收同化及产量的相互作用，利用PLS-PM 进一步解释NR、NiR、GDH、GOGAT、GS对小青菜氮素吸收和产量的直接及间接影响，该模型对数据的拟合优度为0.81。NR 显著影响了NiR 活性（0.895）和氮素累积量（0.642）；GS显著影响了氮素累积量（0.418）；小青菜产量主要受GOGAT（1.33）及氮素累积量（0.859）的影响；NR对产量的影响存在负作用（-1.02）。

图4 偏最小二乘路径（PLS-PM）模型中NR、NiR、GDH、GS及GOGAT对小青菜氮素吸收及产量的直接或间接影响分析（a）和小青菜氮素吸收（b）及产量（c）的影响效应Figure 4 Partial least squares path modeling（PLS-PM）showed the direct and indirect effects of NR,NiR,GDH,GS and GOGAT on nitrogen absorption and yield of Brassica chinensis（a）and effects of NR,NiR,GDH,GS and GOGAT on nitrogen absorption（b）and yield（c）of Brassica chinensis

由图4b 可知，在氮素累积量的总效应中，NR 对其影响最大，为0.802 8，其次是GS、GOGAT，分别为0.390 7 和0.216，GDH 对氮素累积量存在负效应（-0.250 1）。由图4c 可知，在产量的总效应中，所有酶对其影响均为正效应，其中，GS、GOGAT 对其影响最大，分别为0.623 6 和1.513 8，由此说明，GS-GO⁃GAT循环对产量的提升具有重要作用。

3 讨论

3.1 不同稀释倍数热碱液对小青菜SPAD、产量和氮素累积量的影响

喷施蛋白、氨基酸类物质可促进作物体内氮素转化从而提高产量[28]。本研究中，喷施热碱液能促进小青菜对氮素的吸收利用，提高SPAD、产量、氮素吸收效率和利用效率（图1，表2）。有研究表明，小分子有机物不仅可以被植物直接吸收以为自身生长的新陈代谢提供碳源，从而促进作物对养分的吸收利用，刺激根系发育，增加对养分的吸收面积，提高养分累积量，还可为作物直接提供矿物养分，如氨基酸提供氮养分，增加作物体内氮素含量[29]。同时，氮素利用是植物生长发育的重要生理活动，叶绿素含量、酶的调节，对氮素的吸收和利用有很大影响[30]，本试验结果表明随着喷施热碱液稀释倍数的增加，小青菜SPAD、氮素累积量和产量等呈先升高后降低的趋势（图1，表2），并且在稀释倍数为400倍时SPAD、产量和氮素累积量达到最大值，分别为41.87、58.62 g·株-1和126.78 mg·株-1。有研究表明，氨基酸叶面喷施可促进叶菜生长及其对养分的吸收，从而提高产量[31]，同时，

喷施适宜的稀释倍数对叶菜生长的促进效果最佳，这可能是因为在合理的稀释倍数下喷施热碱液，小青菜的叶片可以较大程度地吸收其中的氨基酸等养分，过高稀释倍数会降低养分含量、过低稀释倍数会造成烧苗现象[22]，从而降低喷施效果，对作物生长起到抑制作用[32]。

3.2 不同稀释倍数热碱液对小青菜氮素同化相关酶活性的影响

硝态氮同化过程是主要的氮调控过程，该过程主要受到NR 和NiR 的作用，其中，NR 是氮代谢重要的调节和限速酶[27]。本试验结果表明，喷施热碱液稀释倍数为400 倍的处理能够提高小青菜NR、NiR 活性（图2），同时，NR 对氮素吸收具有重要作用（图4b），也对产量的提升具有正效应（图4c）。这可能是由于热碱液中小分子有机物质加强碳代谢为氮代谢提供能量，提高了NR、NiR活性[28]，从而促进了对氮素的同化，提升了产量。有研究发现，喷施γ-氨基丁酸可使生菜、油菜和韭菜中NR、NiR 活性升高，从而促进叶菜内氮素的同化吸收[33]；叶面喷施蛋氨酸也可提高小白菜中NR、NiR活性，从而促进产量的提升[34]。

硝态氮同化形成的NH+4-N 在GDH 的催化作用下，参与氨基酸降解过程中的氧化脱氨作用，催化合成与分解谷氨酸；在GS-GOGAT 循环途径中形成谷氨酸和谷氨酰胺，最终通过氨基交换作用形成其他氨基酸或酰胺[35-36]。本试验结果表明，随着喷施热碱液稀释倍数的增加各种酶的活性呈先升高后降低的趋势，小青菜在整个生育期中GDH 和GOAGT 活性在稀释倍数为400 倍的条件下表现出较高酶活性，并且能够保持较高水平（图3），但GDH 对氮素吸收存在负效应（图4b），这可能是因为喷施热碱液后作物直接吸收其中小分子氨基酸，当外源小分子氨基酸足够时，小青菜体内氮素同化主要以GS-GOGAT 途径为主，从而使植物体内GDH 途径发生可逆反应，为TCA 循环提供碳骨架[37-38]。在小青菜生长发育第二周和第六周喷施热碱液，GS 活性较第四周有所降低，但在稀释倍数为400 倍时有较高活性（图3），这可能是因为在生长发育前期小青菜直接吸收热碱液中的小分子氨基酸，从而降低了对酰胺等大分子氨基酸的合成，后期作物趋于成熟也会减缓对大分子氨基酸的合成[39-40]，同时GDH 催化作用下会产生H+，H+浓度升高会抑制GS活性，从而造成GS活性下降[41]。GOGAT主要在植物体内参与谷氨酸等小分子的分解和代谢[42]，谷氨酸可以通过植物中的氨基酸转运体被植物直接吸收[43]，同时谷氨酸既是GS 过程的底物，又是循环中关联的GOGAT 过程的产物，为转化为其他氨基酸提供了氨基供体[44]，在氮素吸收中具有重要作用[45]。本研究表明，稀释倍数为400 倍时喷施热碱液对小青菜酶活性具有良好的促进作用（图3），GOGAT对产量的增加具有显著作用（图4c），这可能是因为在合理稀释倍数时，小青菜可最大限度地吸收外源氨基酸等养分，谷氨酰胺和谷氨酸的吸收可促进GS、GOGAT 活性，当其含量充足时会影响作物体内氨同化相关酶基因的表达，从而提高GS、GOGAT 活性[46-47]，促进对氮素的吸收，对小青菜生长产生显著效果。Geng等[48]和Li 等[49]的研究结果表明，适量肥料可提高作物中GS、GOGAT 的活性，促进氮素的累积，从而提升产量，但过量施肥会降低其活性，影响作物产量；也有研究表明，在适宜浓度下对作物进行喷施处理，可提高氮素代谢循环中关键酶活性，从而提高产量[50]。叶面施用氮肥可提高NR、GS 和GOGAT 活性，从而改善氮素营养，提高氮素利用率，促进产量的提升[51]，本试验叶面喷施热碱液促进小青菜氮素的同化机理与前人的研究具有一定的相似性。

4 结论

（1）热碱液在不同喷施稀释倍数（200、400、600、800、1 000 倍）条件下对小青菜产量及氮素同化相关酶活性的影响较大，稀释倍数为400 倍的处理会提高硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，且叶绿素相对含量（SPAD）和产量等达到最高，过高或过低的稀释倍数都会不同程度降低酶活性，从而影响作物对氮素的吸收同化。

（2）通过偏最小二乘路径模型分析可知，NR、GS和GOGAT 对氮素吸收具有显著作用，GOGAT 对产量的增加具有显著效果。