镉胁迫下钝化剂对菠菜生理特征及镉累积的影响

王丽，蔡景行，罗沐欣键，吴道明，范洪黎，秦松，范成五*

（1.贵州省农业科学院土壤肥料研究所，贵阳 550006；2.贵阳市乡村振兴服务中心，贵阳 550081；3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/耕地保护国家工程研究中心/农业农村部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081）

随着社会经济的发展，大量工业活动产生的镉（Cd）被排放到环境中，加上人类不合理的施肥和灌溉等，导致土壤Cd 污染越来越严重。据2014 年《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国土壤总点位超标率达16.1%，其中土壤Cd 点位超标率为7.0%。土壤Cd 污染不仅会破坏生态平衡，而且还会危害人类生命健康。相关研究表明，农田土壤中的Cd 通过食物链进入人体，并与含有羟基、氨基和巯基的蛋白质分子结合，从而抑制酶系统，最终损害肝脏、肾脏和脾脏等，引发多种疾病，包括骨质疏松症、贫血和肺炎等[1]。因此，减轻农田土壤中的Cd 污染，保障农作物的安全生产非常必要。

当前，Cd 污染土壤治理和修复的方法可分为物理法、化学法、生物学法、农艺调控等，或几种方法联合使用[2]。其中，化学法中的原位钝化修复技术由于操作简便、价格低廉、起效快等优点，常被用于修复中轻度污染农田[3]。原位钝化修复技术是通过溶解沉淀、离子交换吸附、氧化还原、有机络合、螯合等反应来改变Cd 在土壤中的赋存状态，从而降低土壤中Cd的迁移性和生物有效性[4]。此外，相关研究表明，无机钝化剂的施用还可以有效提高土壤pH[5]，而土壤pH 是影响土壤重金属Cd 溶解度、形态变化、迁移和生物有效性的主要因子之一[6]。王展等[7]的研究指出，土壤pH 越高，土壤中Cd生物有效性越低，植物所受到的Cd 胁迫程度也会越低。可见，通过施加钝化剂降低土壤Cd 含量是有效的。目前，用于Cd 污染土壤修复的无机钝化材料主要有石灰、石灰石等，但这些材料具有用量过大、吸附效果差、不具备选择性吸附等缺点，因此研究新型钝化材料非常必要。

生物炭内部疏松多孔，比表面积大，吸附能力、氧化能力和阳离子交换能力强，具有修复重金属污染土壤的潜力，另外生物炭可通过生物废弃物制备，在修复土壤的同时还可提高废弃物资源合理利用率[8]，因此受到越来越多学者的关注。相关研究表明，生物炭用于重金属污染土壤的原位钝化修复，可减少作物对重金属的吸收和累积[9]。但由于生物炭吸附稳定效果弱，被吸附的重金属有再次析出的风险，因此需要对生物炭进行改性。现有研究表明，通过巯丙基三甲氧基硅烷制备的巯基生物炭可有效地与Cd2+结合形成结合态，降低土壤Cd 含量[10]。但当前对改性巯基生物炭与无机钝化材料的治理效果的对比研究较少。

蔬菜是人类生活中必不可少的食物，能提供人体所需的重要营养物质。我国蔬菜种植面积和产量均排在世界首位。但近十几年来，我国蔬菜Cd 含量超标问题时有发生，广西、贵州等南方部分地区蔬菜Cd超标率达到了21.10%[11]，严重威胁到农产品生产安全。目前，南方地区针对钝化剂对Cd 污染土壤修复的研究较多，但大部分研究主要侧重于土壤Cd 的钝化效果，少有研究将土壤修复效果和植物生理效应等结合起来，综合分析原位钝化修复对土壤环境和作物的影响。因此，综合分析有机和无机原位钝化修复对土壤环境和作物的影响意义较大。

基于此，本研究以我国南方地区典型蔬菜——菠菜为研究对象，通过设置有机、无机钝化剂单施和配施温室盆栽试验，测定土壤pH、有效态Cd 含量及菠菜抗氧化酶活性，阐明施用不同钝化剂对Cd 胁迫下菠菜生理特征及Cd 累积的影响，为我国南方地区Cd污染土壤治理措施的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自贵州省安顺市，利用多点采样法采集0~20 cm 的污染农田土样，去除表层腐殖质和杂物后，自然风干、混匀、磨碎过筛备用。供试土壤重金属Cd 含量及基本理化性质见表1。供试菠菜（Spinacia oleraceaL.）品种为日本大叶菠菜。供试纳米羟基磷灰石（Nano-hydroxyapatite）购自南京埃普瑞纳米材料有限公司，巯基生物炭通过盐酸催化浸泡法制备：将玉米秸秆生物炭加入到100 mL 浓度为20%的盐酸中，80 ℃条件下搅拌反应4 h，过滤、烘干、研碎，制成氢型生物炭。取所制备的氢型生物炭和巯丙基三甲氧基硅烷按质量比1∶1 混合，常温下反应6 h，过滤、漂洗、烘干，将产物研磨过100 目筛后得到粉末状的巯基改性生物炭备用[12]。试剂盒购自北京太阳生物科技有限公司，测定步骤按照说明书进行。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Basic physical-chemical properties of tested soil

1.2 试验设计

采用温室土培盆栽试验，以菠菜为研究对象，设置不施钝化剂（CK）和施加纳米羟基磷灰石（nHAP）、巯基生物炭（TMB）、纳米羟基磷灰石+巯基生物炭（HPTB）4个处理，每个处理3次重复。

育苗方法：将大小均匀的完整种子经5%（V/V）NaClO 表面消毒15 min，再用去离子水洗涤数次后放入25 ℃的去离子水中浸泡12 h，浸泡完成后，放入营养基质中培养至4片真叶时移栽。

培养条件：单施钝化剂处理各钝化剂按照2%（m∶m）的比例与土壤混合，配施钝化剂处理各钝化剂按照1%（m∶m）的比例与土壤混合，样品混合均匀后称取5 kg 装入深色PVC 方盆（规格为长44 cm、宽20 cm、高11 cm），同时施入底肥，分别为N 0.30 g·kg-1、P2O50.20 g·kg-1、K2O 0.30 g·kg-1，施入形态分别为（NH4）2SO4、KH2PO4、K2SO4。填装好的方盆放于温室中稳定1 周后，将长势均匀的菠菜移栽到方盆中，每盆等距定植4 株。菠菜移栽完成后，在贵州省农业科学院温室自然光条件下培养，温度为25 ℃/20 ℃（昼/夜），相对湿度为65%~75%，植物培养期间每1~2 d浇水1次，土壤湿度保持在田间持水量的60%~70%。

1.3 样品采集及测定

植物样品采集与处理：在移栽后的第72 天采集方盆中的菠菜植株样品，将菠菜按照地上部和地下部分开，根部浸入20 mmol·L-1Na2-EDTA 中15 min以除去附着在根表面的Cd2+，然后用自来水和去离子水冲洗。地下部和部分地上部植株样品在105 ℃下杀青30 min 后，在70 ℃下干燥至质量恒定，然后用球磨仪磨碎装袋备用。准备称取处理后的样品0.500 0 g 于凯氏定氮瓶中，并加入4 mL HNO3-HClO4混合酸（优级纯，体积比4∶1）10 mL 混匀，冷消化过夜。将消煮管置于消煮炉上，120 ℃加热60 min，再在180 ℃下消化至溶液变为无色透明，稍冷却后，用超纯水转移并定容至50 mL，同时做试剂空白。采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，7700x，Agilent，美国）测定植株的Cd含量，测定方法参照《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》（GB 5009.268—2016）。部分植株叶片在-20 ℃保存，用于测定过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。测定步骤按照相应试剂盒的说明书进行。

土壤pH 测定采用玻璃电极法，水土比为2.5∶1。土样经王水+H2O2微波消解冷却后用超纯水定容至50 mL 用于测定全Cd 含量，土样经0.1 mol·L-1CaCl2浸提液浸提后用于测定有效态Cd含量。采用电感耦合等离子体质谱仪进行土壤Cd含量的测定。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2010 对试验数据进行整理和统计；利用SPSS 22软件中的LSD 法进行单向方差分析（ANO⁃VA），比较基于ANOVA 得出的最小显著差异值的结果，P<0.05被认为具有统计学意义；采用Pearson 相关性分析法对数据进行相关性分析；利用GraphPad Prism 6、Origin 2022软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同钝化剂处理对菠菜生物量的影响

由图1 可知，不同处理下菠菜地上部生物量为5.91~19.81 g·盆-1，地下部生物量为0.66~1.59 g·盆-1，各处理菠菜不同部位生物量均为HPTB>nHAP>TMB>CK，HPTB、nHAP、TMB 处理地上部生物量分别较CK增加了143.75%、90.27%、7.28%，地下部生物量分别增加了91.71%、72.50%、4.81%。HPTB 和nHAP 处理下菠菜生物量显著高于CK。结果表明，施用nHAP、TMB、HPTB均能增加菠菜地上部和地下部生物量，其中，HPTB的菠菜生物量最大，nHAP次之。

图1 不同处理对菠菜生物量的影响Figure 1 Effects of different treatments on the biomass of Spinacia oleracea L.

2.2 不同钝化剂处理对菠菜Cd含量的影响

由图2 可知，不同处理下菠菜地上部Cd 含量为0.29~1.46 mg·kg-1，地下部Cd 含量为0.44~1.52 mg·kg-1，各处理菠菜不同部位Cd 含量均为CK>TMB>HPTB>nHAP，与CK 相比，TMB、HPTB、nHAP 处理下地上部Cd 含量分别降低了6.94%、65.49%、78.19%，地下部Cd 含量分别降低了39.34%、52.31%、65.98%，nHAP、HPTB 处理下菠菜地上部Cd 含量显著低于CK和TMB，nHAP、TMB、HPTB 处理下菠菜地下部Cd 含量均显著低于CK。结果表明，nHAP、TMB、HPTB 均能降低菠菜地上部和地下部Cd 含量，其中nHAP 的菠菜Cd含量最低。

图2 不同处理对菠菜Cd含量的影响Figure 2 Effects of different treatments on the Cd content of Spinacia oleracea L.

2.3 不同钝化剂处理对土壤pH 和有效态Cd 含量的影响

如图3 所示，nHAP、TMB、HPTB 处理下土壤pH较CK 分别提高了1.36、0.08、0.76 个单位，nHAP 和HPTB 与CK 存在显著差异，TMB 与CK 无显著差异。相较于CK，nHAP、TMB、HPTB 的土壤有效态Cd 含量分别显著降低了83.22%、22.57%、73.70%。结果表明，不同钝化剂处理均能提高土壤pH、降低土壤有效态Cd含量，其中nHAP效果最为明显。

图3 不同处理对土壤pH和有效态Cd的影响Figure 3 Effects of different treatments on the pH and available Cd content of soil

2.4 不同钝化剂处理对菠菜抗氧化系统的影响

由图4 可知，nHAP、TMB、HPTB 处理下菠菜CAT活性与CK 无显著差异。CK、nHAP、HPTB 处理下菠菜POD 活性无显著差异，但均显著高于TMB，分别增加了21.56%、33.51%和16.00%。nHAP 处理下SOD活性显著高于其他处理，MDA 含量显著低于其他处理。结果表明，施用nHAP 可以提高菠菜叶片抗氧化酶的活性，缓解Cd胁迫下脂膜过氧化伤害。

图4 不同处理对菠菜抗氧化系统的影响Figure 4 Effects of different treatments on the antioxidant system of Spinacia oleracea L.

2.5 相关性分析

由图5 可知，CAT、POD、SOD 活性均与MDA 含量呈负相关，其中POD活性与MDA含量呈显著负相关，相关系数为-0.66，SOD 活性与MDA 含量呈极显著负相关，相关系数为-0.79。CAT、POD、SOD 活性均与pH 呈正相关，其中，POD 活性与pH 呈显著正相关，相关系数为0.64，SOD 活性与pH 呈极显著正相关，相关系数为0.73。有效态Cd 含量与pH 呈极显著负相关，与地上部Cd含量呈极显著正相关，相关系数为0.97。

图5 相关性分析Figure 5 Correlation analysis

3 讨论

钝化剂可通过降低土壤中重金属的活性来减轻其对作物的毒害[13]。本研究结果表明，nHAP、TMB、HPTB 均能增加菠菜地上部和地下部生物量。土壤pH 是影响Cd 活性最重要的因素之一[14]，本研究结果表明，钝化剂的施加可有效提高土壤pH，降低土壤Cd 含量，这与徐万强等[15]的研究结果一致，这是由于经钝化剂处理后，土壤pH 上升增加了土壤表面负电荷，提高了对Cd2+的吸附，同时产生的碳酸盐沉淀[16]有效降低了土壤中CaCl2提取态的Cd 含量，进而降低了菠菜对Cd 的吸收。此外，Cao 等[17]的研究也指出，在Cd 污染酸性农田中施入海泡石可有效提高土壤pH，降低土壤中CaCl2提取态的Cd 含量，从而减少了小白菜对Cd的吸收。本研究发现，nHAP处理的菠菜Cd含量最低，这一方面是由于nHAP的添加提高了土壤pH，从而改变了Cd 的存在形态，降低了土壤中Cd的可迁移性，进而达到降低菠菜Cd 含量的效果[18]。另一方面是由于纳米级的羟基磷灰石具有高比表面积、组织相容性、多孔性、吸附性等理化性质，本身晶格中的Ca2+可以更好地与土壤中的Cd2+进行离子交换或表面吸附反应等，形成更稳定的Cd 磷灰石[19-20]，进而降低菠菜对Cd 累积。而TMB 钝化效果不如nHAP的原因可能是巯基改性处理为生物炭嫁接了巯基，使得生物炭在酸性条件下仍能有效地吸附重金属Cd，但是巯基改性处理会减少生物炭孔隙[21]。

当植物受到重金属胁迫时，体内会产生大量的活性氧自由基（ROS），CAT、POD 和SOD 等可以通过清除ROS 来抵御ROS 对细胞膜造成的伤害[22]。当ROS含量增加时会引起脂质过氧化，MDA 是细胞膜脂质过氧化的最终产物，其含量高低反映了脂质过氧化的强弱程度[23]。植物体在Cd 污染下会加强叶片的膜脂过氧化产生MDA，提高植物细胞膜通透性[24]。本试验中，不同钝化剂处理对抗氧化酶活性和MDA 含量的影响不同，nHAP 处理下菠菜CAT、POD 和SOD 活性均提高，MDA 含量降低，这与张伟等[25]的研究结果一致，可能是因为nHAP 的应用诱导了H2O2的升高，从而激活了抗氧化酶合成的代谢途径[26]，加入nHAP后能够有效地缓解Cd 污染对菠菜的伤害，降低MDA的含量。

分析发现，CAT、POD、SOD 均与pH 呈正相关，其中POD 与pH 呈显著正相关，SOD 与pH 呈极显著正相关，这与杜志敏等[27]的研究结果相似。首先，这可能是因为随着土壤pH 的增加，重金属活性降低，减少了重金属对土壤酶活性中心的占据及与酶分子基团的结合，进而降低了重金属对酶活性基团空间结构的破坏以及对酶催化能力及其对酶合成的抑制作用；其次，重金属活性的降低使得土壤微生物群落结构发生变化，且微生物生长繁殖增强，间接提高了土壤酶活性[28]；由于菠菜的不断生长，菠菜的根系分泌物、凋落物、腐烂根系等增多，这也间接促进了土壤酶活性的提高。相关性分析表明，土壤有效态Cd 和土壤pH 呈极显著负相关关系，这与武琳等[29]的研究结果一致。这可能是由于施用钝化剂后土壤pH 升高，一方面使土壤中黏土矿物、水合氧化物和有机质表面的负电荷增加，从而对Cd2+的吸附力增强，促进了CdCO3和Cd（OH）2沉淀的生成[30]，生成的Cd沉淀也是施入生物炭使土壤碳酸盐结合态Cd 含量升高的原因。另一方面，土壤pH 升高时H+浓度减小，从而降低了H+和Cd2+在吸附位点上的竞争，使得土壤中的有机质、铁锰氧化物等与重金属的结合更紧密[31]。

4 结论

（1）施用纳米羟基磷灰石、巯基生物炭、纳米羟基磷灰石+巯基生物炭均可缓解Cd胁迫对菠菜的影响，促进菠菜生长，纳米羟基磷灰石+巯基生物炭的促生效果最好，纳米羟基磷灰石次之。

（2）不同钝化剂均能提高土壤pH，降低土壤有效态Cd 含量，减少菠菜地上部和地下部对Cd 的吸收；施用纳米羟基磷灰石能够增加抗氧化酶活性，降低MDA含量，修复损伤细胞膜，缓解脂膜过氧化伤害。

（3）综上，纳米羟基磷灰石在一定程度上缓解了Cd 污染对菠菜叶片细胞的伤害，增强了菠菜对Cd 胁迫的抵抗能力，可作为缓解Cd 污染对菠菜产生生理影响的钝化剂。